Tableau II: Amorces utilisées pour l’amplification de la région 5’(ORF1a et ORF1b)

suite du tableau

[0211] Tous les fragments ont été amplifiés dans les conditions suivantes, excepté le fragment L0 qui a été amplifié comme décrit ci-dessus pour l’ORF-M :

• –  RT-PCR: 30 min à 42°C, 15 min à 55°C, 2 min à 94°C, puis l’ADNc obtenu est amplifié dans les conditions suivantes : 40 cycles comprenant : une étape de dénaturation à 94°C pendant 15 sec, une étape d’hybridation à 58°C pendant 30 sec puis une étape d’élongation à 68°C pendant 1 min 30 sec, avec 5 sec d’élongation supplémentaire à chaque cycle, puis une étape finale d’élongation à 68°C pendant 7 min.
• –  PCR nichée : une étape initiale de dénaturation à 94°C pendant 2 min est suivie de 3 cycles comprenant : une étape de dénaturation à 94°C pendant 15 sec, une étape d’hybridation à 60°C pendant 30 sec puis une étape d’élongation à 72°C pendant 1 min 30 sec, avec 5 sec d’élongation supplémentaire à chaque cycle, puis une étape finale d’élongation à 72°C pendant 7 min.

[0212] Les produits d’amplifications ont été séquencés à l’aide des amorces définies dans le Tableau III ci-après :

Tableau III : Amorces utilisées pour le séquençage de la région 5’ (ORF1a et ORF1b)

suite du tableau

[0213] Les séquences des fragments L0 à L12 de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n° 031589, correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO :41 à SEQ ID NO :54 dans la liste de séquences jointe en annexe. Parmi ces séquences, seule celle correspondant aux fragments L5 comporte une différence nucléo-tidique par rapport à la séquence correspondante de l’isolat AY278741-Urbani. Cette mutation t/c en position 7919 aboutit à une modification de la séquence en acides aminés de la protéine correspondante, codée par l’ORF la: en position 2552, une valine (codon gtt ; AY278741) est changée en alanine (codon gct) dans la souche de SARS-CoV 031589. En revanche, aucune mutation n’a été identifiée par rapport à la séquence correspondante de l’isolat AY274119.3-Tor2. Les autres fragments ne présentent pas de différences par rapport aux séquences correspondantes des isolats Tor2 et Urbani.

Exemple 2 : Production et purification de protéines N et S recombinantes de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le numéro 031589

[0214] La protéine entière N et deux fragments polypeptidiques de la protéine S de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le numéro 031589 ont été produites chez E. coli, sous forme de protéines de fusion comprenant une étiquette polyhistidine N-ou C-terminale. Dans les deux polypeptides S, les séquences hydrophobes N et C-terminales de la protéine S (peptide signal : positions 1 à 13 et hélice transmembranaire : positions 1196 à 1218) ont été délétées alors que l’hélice â (positions 565 à 687) et les deux motifs de type coiled-coils (positions 895 à 980 et 1155 à 1186) de la protéine S ont été préservés. Ces deux polypeptides sont constitués par : un fragment long (SL) correspondant aux positions 14 à 1193 de la séquence en acides aminés de la protéine S et un fragment court (SC) correspondant aux positions 475 à 1193 de la séquence en acides aminés de la protéine S. 1) Clonage des ADNc N, SL et SC dans les vecteurs d’expression pIVEX2.3 et

pIVEX2.4

[0215] Les ADNc correspondant à la protéine N et aux fragments SL et SC ont été amplifiés par PCR dans des conditions standard, à l’aide de l’ADN polymérase Platinium Pfx® (INVITROGEN). Les plasmides SRAS-N et SRAS-S ont été utilisés comme matrice et les oligonucléotides suivants comme amorces :

5’-CCCATATGTCTGATAATGGACCCCAATCAAAC-3’ (N sens, SEQ ID NO :55) 5’-CCCCCGGGTGCCTGAGTTGAATCAGCAGAAGC-3’ (N antisens, SEQ ID NO :56) 5’-CCCATATGAGTGACCTTGACCGGTGCACCAC-3’ (SC sens, SEQ ID NO :57) 5’-CCCATATGAAACCTTGCACCCCACCTGCTC-3’ (SL sens, SEQ ID NO :58) 5’-CCCCCGGGTTTAATATATTGCTCATATTTTCCC-3’ (SC et SL antisens, SEQ ID NO :59).

[0216] Les amorces sens introduisent un site NdeI (souligné) alors que les amorces antisens introduisent un site XmaI ou SmaI (souligné). Les 3 produits d’amplification on été purifiés sur colonne (kit QIAquick PCR Purification, QIAGEN) et clonés dans un vecteur approprié. L’ADN plasmidique purifié des 3 constructions (kit QIAFilter Midi Plasmid, QIAGEN) a été vérifié par séquençage et digéré par les enzymes NdeI et XmaI. Les 3 fragments

correspondants aux ADNc N, SL et SC ont été purifiés sur gel d’agarose puis insérés dans les plasmides pIVEX2.3MCS (étiquette polyhistidine C- terminale) et pIVEX2.4d (étiquette polyhistidine N-terminale) préalablement digérés par les mêmes enzymes. Après vérification des constructions, les 6 vecteurs d’expressions ainsi obtenus (pIV2.3N, pIV2.3SC, pIV2.3SL, pIV2.4N, pIV2.4SC également dénommé pIV2.4SI, pIV2.4SL) ont été ensuite utilisés, d’une part pour tester l’expression des protéines in-vitro, et d’autre part pour transformer la souche bactérienne BL21(DE3)pDIA17 (NOVAGEN). Ces cons- tructions codent pour des protéines dont la masse moléculaire attendue est la suivante : pIV2.3N (47174 Da), pIV2.3SC (82897 Da), pIV2.3SL (132056 Da), pIV2.4N (48996 Da), pIV2.4SI (81076 Da) et pIV2.4SL(133877 Da). Des bactéries transformées par pIV2.3N ont été déposées à la CNCM le 23 octobre 2003, sous le numéro I-3117, et des bactéries transformées par pIV2.4SI ont été déposées à la CNCM le 23 octobre 2003, sous le numéro I-3118.

2) Analyse de l’expression des protéines recombinantes in-vitro et in vivo

[0217] L’expression de protéines recombinantes à partir des 6 vecteurs recombinants a été testée, dans un premier temps, dans un système in-vitro (RTS100, Roche). Les protéines produites in vitro, après une incubation des vecteurs recombinants pIVEX, 4h à 30°C, dans le système RTS100, ont été analysées par westem-blot à l’aide d’un anticorps anti-(his)6 couplé à la péroxydase. Le résultat d’expression in-vitro (Figure 1) montre que seule la protéine N est exprimée en quantités importantes, cela quelle que soit la position, N- ou C-terminale, de l’étiquette polyhistidine. Dans une seconde étape, l’expression des protéines N et S a été testée in-vivo à 30°C dans du milieu LB, en présence ou en l’absence d’inducteur (IPTG 1mM). La protéine N est très bien produite dans ce système bactérien (Figure 2) et se retrouve principalement dans une fraction soluble après lyse des bactéries. En revanche, la version longue de S (SL) est très peu produite et complètement insoluble (Figure 3). La version courte (SC) présente également une très faible solubilité, mais un taux d’expression beaucoup plus élevé que celui de la version longue. Par ailleurs, la construction SC fusionnée à une étiquette polyhistidine en position C-terminale présente une taille plus faible que celle attendue. Une expérience d’immunodétection avec un anticorps anti-polyhistidine a montré que cette construction était incomplète. En conclusion, les deux constructions, pIV2.3N et pIV2.4SI, exprimant respectivement la protéine N entière fusionnée à l’étiquette polyhistidine en C-terminal et la protéine S courte fusionnée à l’étiquette polyhistidine en N-terminal, ont été retenues pour produire les deux protéines en grande quantité afin de les purifier. Les plasmides pIV2.3N et pIV2.4SI ont été déposés respectivement sous le n° I-3117 et I-3118 auprès de la CNCM, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS 15, le 23 octobre 2003.

3) Analyse de l’activité antigénique des protéines recombinantes

[0218] L’activité antigénique des protéines N, SL et SC a été testée par western-blot, à l’aide de deux échantillons de sérum, provenant d’un même patient infecté par le SARS-CoV, prélevés 8 jours (M12) et 29 jours-(M13) après le début des symptômes du SRAS. Le protocole expérimental est comme décrit à l’exemple 3. Les résultats illustrés par la figure 4 montrent (i) la séroconversion du patient, et (ii) que la protéine N possède une plus forte réactivité antigénique que la protéine S courte.

4) Purification de la protéine N à partir de pIV2.3N

[0219] Plusieurs expériences de purification de la protéine N, produite à partir du vecteur pIV2.3N, ont été réalisées selon le protocole suivant. Les bactéries BL21(DE3)pDIA17, transformées par le vecteur d’expression pIV2.3N, ont été cultivées à 30°C dans 1 litre de milieu de culture contenant 0,1 mg/ml d’ampicilline, et induites par 1 mM IPTG quand la densité cellulaire, équivalente à A600 = 0,8, est atteinte (environ 3 heures). Après 2 heures de culture en présence d’inducteur, les cellules ont été récupérées par centrifugation (10 min à 5000 rpm), remises en suspension dans le tampon de lyse (50 mM NaH2PO4, NaCl 0,3 M, 20 mM imidazole, pH 8 contenant le mélange d’inhibiteurs de protéases Complete®, Roche), et lysées par la presse de French (12000 psi). Après centrifugation du lysat bactérien (15 min à 12000 rpm), le surnageant (50 ml) a été déposé à un débit de lml/min sur une colonne (15 ml) de chélation métallique (Ni-NTA superflow, Qiagen), équilibrée par le tampon de lyse. Après lavage de la colonne par 200 ml de tampon de lyse, la protéine N a été éluée par un gradient d’imidazole (20 →250 mM) en 10 volumes de colonne. Les fractions contenant la protéine N ont été rassemblées et analysées par électrophorèse en gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes puis coloration au bleu de Coomassie. Les résultats illustrés par la figure 5 montrent que le protocole employé permet de purifier la protéine N avec une homogénéité très satisfaisante (95%) et un rendement moyen de 15 mg de protéine par litre de culture.

5) Purification de la protéine SC à partir de pIV2.4SC (pIV2.4SI)

[0220] Le protocole suivi pour purifier la protéine S courte est très différent de celui décrit ci-dessus car la protéine est fortement agrégée dans le système bactérien (corps d’inclusion). Les bactéries BL21(DE3)pDIA17, transformées par le vecteur d’expression pIV2.4SI ont été cultivées à 30°C dans 1 litre de milieu de culture contenant 0,1 mg/ml d’ampicilline, et induites par 1 mM IPTG quand la densité cellulaire, équivalente à A600 = 0,8, est atteinte (environ 3 heures). Après 2 heures de culture en présence d’inducteur, les cellules ont été récupérées par centrifugation (10 min à 5000 rpm), remises en suspension dans le tampon de lyse (0,1 M Tris-HCl, EDTA 1 mM, pH 7,5), et lysées par la presse de French (1200 psi). Après centrifugation du lysat bactérien (15 min à 12000 rpm), le culot a été remis en suspension dans 25 ml de tampon de lyse contenant 2% Triton X100 et 10 mM â-mercaptoéthanol, puis centrifugé pendant 20 min à 12000 rpm. Le culot a été remis en suspension dans un tampon Tris-HCl 10 mM contenant 7 M urée, et mis en agitation douce pendant 30 min à température ambiante. Ce dernier lavage des corps d’inclusion avec 7 M urée est nécessaire pour éliminer la plupart des protéines membranaires d’E. coli qui co-sédimentent avec la protéine SC agrégée. Après une dernière centrifugation pendant 20 min à 12000 rpm, le culot final est remis en suspension dans le tampon Tris-HCl 10 mM. L’analyse électrophorétique de cette préparation (Figure 6) montre que la protéine S courte peut être purifiée avec une homogénéité satisfaisante (environ 90%) à partir des corps d’inclusion (extrait insoluble).

Exemple 3 : Immunodominance de la protéine N

[0221] La réactivité des anticorps présents dans le sérum des patients atteints de pneumopathie atypique causée par le coronavirus associé au SRAS (SARS-CoV), vis-à-vis des différentes protéines de ce virus, a été analysée par western- blot dans les conditions décrites ci-après.

1) Matériel

1. a) lysat de cellules infectées par le SARS-CoV

[0222] Des cellules Vero E6 (2×106) ont été infectées par le SARS-CoV (isolat répertorié sous le numéro FFM/MA104) à une multiplicité d’infection (M.O.I.) de 10-1 ou 10-2 puis incubées dans du milieu DMEM contenant 2% de SVF, à 35°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2. 48 heures plus tard, le tapis cellulaire a été lavé avec du PBS puis lysé avec 500 €l de tampon de dépôt préparé selon Laemmli et contenant du â-mercaptoéthanol. Les échantillons ont ensuite été bouillis 10 minutes puis soniqués 3 fois 20 secondes.

1. b) anticorps

b1) sérum de patient atteint de pneumopathie atypique

[0223] Le sérum référencé au Centre National de Référence des virus influenzae (Région-Nord) sous le N° 20033168 est celui d’un patient français atteint d’une pneumopathie atypique causée par le SARS-CoV prélevé au jour 38 après le début des symptômes ; le diagnostic d’infection par le SARS-CoV a été réalisé par RT-PCR nichée et PCR quantitative.

b2) sérums polyclonaux de lapin monospécifiques dirigés contre la protéine N ou la protéine S

[0224] Les sérums sont ceux produits à partir des protéines recombinantes N et SC (exemple 2), selon le protocole d’immunisation décrit à l’exemple 4 ; il s’agit du sérum du lapin P13097 (sérum anti-N) et du sérum du lapin P11135 (sérum anti-S).

2) Méthode

[0225] 20 €l de lysat de cellules infectées par le SARS-CoV à des M.O.I. de 10-1 et 10-2 et, à titre de contrôle, 20 €l d’un lysat de cellules non infectées (mock) ont été séparés sur un gel SDS à 10% de polyacrylamide puis transférés sur une membrane de nitrocellulose. Après blocage dans une solution de PBS/lait 5%/Tween 0,1% et lavage en PBS/ Tween 0,1%, cette membrane a été hybridée pendant une nuit à 4°C avec : (i) l’immun-sérum N° 20033168 dilué au 1/300, 1/1000 et 1/3000 dans le tampon PBS/BSA 1%/Tween 0,1%, (ii) le sérum du lapin P13097 (sérum anti-N) dilué au 1/50000 dans le même tampon et (iii) le sérum du lapin P11135 (sérum anti-S) dilué au 1/10000 dans le même tampon. Après lavage en PBS/Tween, une hybridation secondaire a été réalisée à l’aide, soit d’anticorps polyclonaux de mouton dirigés contre les chaînes lourdes et légères des immunoglobulines G humaines et couplés à la peroxidase (NA933V, Amersham), soit d’anticorps polyclonaux d’âne dirigés contre les chaînes lourdes et légères des immunoglo- bulines G de lapin et couplés à la peroxidase (NA934V, Amersham). Les anticorps fixés ont été révélés à l’aide du kit ECL+ (Amersham) et de films d’autoradiographie Hyperfilm MP (Amersham). Une échelle de masse moléculaire (kDa) est portée sur la figure.

3) Résultats

[0226] La figure 7 montre que trois polypeptides de masse moléculaire apparente 35, 55 et 200 kDa sont détectés spécifiquement dans les extraits de cellules infectées par le SARS-CoV.
[0227] Afin d’identifier ces polypeptides, deux autres immunoempreintes (figure 8) ont été réalisées sur les mêmes échantillons et dans les mêmes conditions avec des anticorps polyclonaux de lapins spécifique de la nucléoprotéine N (lapin P13097, figure 8A) et de la protéine de spicule S (lapin P11135, figure 8B) Cette expérience montre que le polypeptide de 200 kDa correspond à la glycoprotéine de spicule S du SARS-CoV, que le polypeptide de 55 kDa correspond à la nucléoprotéine N tandis que le polypeptide de 35 kDa représente vraisemblablement une forme tronquée ou dégradée de la N.

[0228] Les données présentées dans la figure 7 montrent donc que le sérum 20033168 réagit fortement avec la N et beaucoup plus faiblement avec la S du SARS-CoV, puisque les polypeptides de 35 et 55 kDa sont révélés sous la forme de bandes intenses pour des dilutions de 1/300, 1/1000 et 1/3000 de l’immunsérum alors que le polypeptide de 200 kDa n’est que faiblement révélé pour une dilution de 1/300. On peut noter également qu’aucun autre polypeptide du SARS-CoV n’est détecté pour des dilutions supérieures au 1/300 du sérum 20033168.

[0229] Cette expérience indique que la réponse en anticorps spécifique de la N du SARS-CoV domine les réponses en anticorps spécifiques des autres polypeptides du SARS-CoV et en particulier la réponse en anticorps dirigée contre la glycoprotéine S. Elle indique une immunodominance de la nucléoprotéine N lors des infections humaines par le SARS- CoV.

Exemple 4 : Réparation d’anticorps polyclonaux monospécifiques dirigés contre les protéines N et S du co- ronavirus associé au SRAS (SARS-CoV)

1) Matériel et méthode

[0230] Trois lapins (P13097, P13081, P13031) ont été immunisés avec le polypeptide recombinant purifié correspon- dant à l’intégralité de la nucléoprotéine (N), préparé selon le protocole décrit à l’exemple 2. Après une première injection de 0,35 mg par lapin de protéine émulsionnée en adjuvant complet de Freund (voie intradermique), les animaux ont reçus 3 injections de rappel à 3 puis 4 semaines d’intervalle, de 0,35 mg de protéine recombinante émulsionnée en adjuvant incomplet de Freund.

[0231] Trois lapins (P11135, P13042, P14001) ont été immunisés avec le polypeptide recombinant correspondant au fragment court de la protéine S (SC), produit comme décrit à l’exemple 2. Comme ce polypeptide est retrouvé principa- lement sous la forme de corps d’inclusion dans le cytoplasme bactérien, les animaux ont reçus 4 injections intra-dermiques à 3-4 semaines d’intervalle d’une préparation de corps d’inclusion correspondant à 0,5 mg de protéine recombinante émulsionnée en adjuvant incomplet de Freund. Les 3 premières injections ont été réalisées avec une préparation de corps d’inclusion préparés selon le protocole décrit à l’exemple 2, tandis que la quatrième injection a été réalisée avec une préparation de corps d’inclusion qui ont été préparés selon le protocole décrit à l’exemple 2 puis purifiés sur gradient de saccharose et lavés en 2 % Triton X100.

[0232] Pour chaque lapin, un sérum pré-immun (p.i.) a été préparé avant la première immunisation et un immun- sérum (I.S.) 5 semaines après la quatrième immunisation.
[0233] Dans un premier temps, la réactivité des sérums a été analysée par test ELISA vis à vis de préparations de protéines recombinantes semblables à celles utilisées pour les immunisations ; les tests ELISA ont été réalisés selon le protocole et avec les réactifs tels que décrits à l’exemple 6.

[0234] Dans un deuxième temps, la réactivité des sérums a été analysée en réalisant une immunoempreinte (western blot) d’un lysat de cellules infectées par le SARS-CoV, en suivant le protocole tel que décrit à l’exemple 3.

2) Résultats

[0235] Les tests ELISA (figure 9) démontrent que les préparations de protéine N recombinante et de corps d’inclusion du fragment court de la protéine S (SC) sont immunogènes chez l’animal et que le titre des sérums immuns est élevé (plus de 1/25000).
[0236] L’immunoempreinte (figure 8) montre que le sérum immun du lapin P13097 reconnaît deux polypeptides pré- sents dans les lysats de cellules infectées par le SARS-CoV : un polypeptide dont la masse moléculaire apparente (50-55 kDa selon les expériences) est compatible avec celle de la nucléoprotéine N (422 résidus, masse moléculaire prédite de 46 kDa) et un polypeptide de 35 kDa, qui représente vraisemblablement une forme tronquée ou dégradée de la N.

[0237] Cette expérience montre également que le sérum du lapin P11135 reconnaît principalement un polypeptide dont la masse moléculaire apparente (180-220 kDa selon les expériences) est compatible avec une forme glycosylée de la S (1255 résidus, chaîne polypeptidique non glycosylée de 139 kDa), ainsi que des polypeptides plus légers, qui représentent vraisemblablement des formes tronquées et/ou non glycosylées de la S.

[0238] En conclusion, l’ensemble de ces expériences démontrent que des polypeptides recombinants exprimés chez E. coli et correspondant aux protéines N et S du SARS-CoV permettent d’induire chez l’animal des anticorps polyclonaux capables de reconnaître les formes natives de ces protéines.

Exemple 5 : Préparation d’anticorps polyclonaux monospécifiques dirigés contre les protéines M et E du coronavirus associé au SRAS (SARS-CoV)

1) Analyse de la structure des protéines M et E

a) Protéine E

[0239] La structure de la protéine E du SARS-CoV (76 acides aminés) a été analysée in silico , à l’aide de différents logiciels comme signalP v1.1, NetNGlyc 1.0, THMM 1.0 et 2.0 (Krogh et al., 2001, J. Mol. Biol., 305(3):567-580) ou encore TOPPRED (von Heijne, 1992, J. Mol. Biol. 225, 487-494). L’analyse montre que ce polypeptide non glycosylé est une protéine membranaire de type 1, contenant une seule hélice transmembranaire (aa 12-34 d’après THMM), et dont la plus grande partie du domaine hydrophile (42 résidus) est localisée à l’extrémité C-terminale et vraisemblablement à l’intérieur de la particule virale (endodomaine). On peut noter une inversion dans la topologie prédite par les versions 1.0 (N-ter est externe) et 2.0 (N-ter est interne) du logiciel THMM, mais que d’autres algorithmes, notamment TOPPRED et THUMBUP (Zhou et Zhou, 2003, Protein Science 12 :1547-1555) confirment une localisation externe de l’extrémité N-terminale de E.

b) Protéine M

[0240] Une analyse similaire réalisée sur la protéine M du SARS-CoV (221 acides aminés) montre que ce polypeptide ne possède pas de peptide signal (d’après le logiciel signalP v1.1) mais trois domaines transmembranaires (résidus 15-37, 50-72, 77-99 d’après THMM2.0) et un grand domaine hydrophile (aa 100-221) localisé à l’intérieur de la particule virale (endodomaine). Elle est vraisemblablement glycosylée sur l’asparagine en position 4 (d’après NetNGlyc 1.0). [0241] Ainsi, en accord avec les données expérimentales connues pour les autres coronavirus, il est remarquable que les deux protéines M et E présentent des endodomaines correspondant à la majeure partie des polypeptides et des ectodomaines de très petite taille.

• –  l’ectodomaine de E correspond vraisemblablement aux résidus 1 à 11 ou 1 à 12 de la protéine : MYSFVSEETGT (L), SEQ ID NO : 70. En effet, la probabilité associée à la localisation transmembranaire du résidu 12 est intermédiaire (0,56 d’après THMM 2.0).
• –  l’ectodomaine de M correspond vraisemblablement aux résidus 2 à 14 de la protéine : ADNGTITVEELKQ, SEQ ID NO : 69. En effet, la méthionine N-terminale de M est très probablement clivée du polypeptide mature car le résidu en position 2 est une Alanine (Varshavsky, 1996, 93:12142-12149).

[0242] Par ailleurs, l’analyse de l’hydrophobicité (Kyte & Doolittle, Hopp & Woods) de la protéine E met en évidence que l’extrémité C-terminale de l’endodomaine de E est hydrophile et donc vraisemblablement exposée à la surface de ce domaine. Ainsi, un peptide synthétique correspondant à cette extrémité est un bon candidat immunogène pour induire chez l’animal des anticorps dirigés contre l’endodomaine de E. En conséquence, un peptide correspondant aux 24 résidus C-terminaux de E a été synthétisé.

2) Préparation d’anticorps dirigés contre l’ectodomaine des protéines M et E et l’endodomaine de la protéine E

[0243] Les peptides M2-14 (ADNGTITVEELKQ, SEQ ID NO : 69), E1-12 (MYSFVSEETGTL, SEQ ID NO: 70) et E53-76 (KPTVYVYSRV KNLNSSEGVP DLLV, SEQ ID NO : 71) ont été synthétisés par Neosystem. Ils ont été couplés à la KLH (Keyhole Limpet Heinocyanin) à l’aide du MBS (m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester) via une cystéine ajoutée au cours de la synthèse soit en N-terminal du peptide (cas de E53-76) soit en C-terminal (cas de M2-14 et E1-12).

[0244] Deux lapins ont été immunisés avec chacun des conjugués, en suivant le protocole d’immunisation suivant : après une première injection de 0,5 mg de peptide couplé à la KLH et émulsionné en adjuvant complet de

Freund (voie intradermique), les animaux reçoivent 2 à 4 injections de rappel à 3 ou 4 semaines d’intervalle de 0,25 mg de peptide couplé à la KLH et émulsionné en adjuvant incomplet de Freund.

[0245] Pour chaque lapin, un sérum pré-immun (p.i.) a été préparé avant la première immunisation et un immun- sérum (I.S.) est préparé 3 à 5 semaines après les injections de rappel.
[0246] La réactivité des sérums a été analysée par western blot à l’aide d’extraits de cellules infectées par le SRAS- CoV (figure 43B) ou à l’aide d’extraits de cellules infectées par un virus recombinant de la vaccine exprimant la protéine E (VV-TG-E, figure 43A) ou M (VV-TN-M, figure 43C) de l’isolat 031589 du SRAS-CoV.

[0247] Les immunsérums des lapins 22234 et 22240, immunisés par le conjugué KLH-E53-76, reconnaissent un polypeptide d’environ 9 à 10kD, qui est présent dans les extraits de cellules infectées par le SRAS-CoV mais absent dans les extraits de cellules non infectées (figure 43B). La masse apparente de ce polypeptide est compatible avec la masse prédite de la protéine E, qui est de 8,4 kD. De façon similaire, l’immunsérum du lapin 20047, immunisé par le conjugué KLH-E1-12, reconnaît un polypeptide présent dans les extraits de cellules infectées par le virus VV-TG-E, dont la masse molaire apparente est compatible avec celle de la protéine E (figure 43A).

[0248] L’immunsérum des lapin 20013 et 20080, immunisés par le conjugué KLH-M2-14, reconnaît un polypeptide présent dans les extraits de cellules infectées par le virus VV-TN-M (figure 43C), dont la masse molaire apparente (18 kD environ) est compatible avec celle de la glycoprotéine M, qui est de 25,1 kD et présente un point isoélectrique élevé (9.1 pour le polypeptide nu).

[0249] Ces résultats démontrent que les peptides El-12 et E53-76 d’une part et le peptide M2-14 d’autre part permettent d’induire chez l’animal des anticorps polyclonaux capables de reconnaître les formes natives des protéines E et M respectivement du SRAS-CoV.

Exemple 6 : Analyse de la réactivité en ELISA de la protéine N recombinante, vis-à-vis de sérums de patients atteints de SRAS

1) Matériel

[0250] L’antigène utilisé pour préparer les phases solides est la nucléoprotéine N recombinante purifiée préparée selon le protocole décrit à l’exemple 2.
[0251] Les sérums à tester (Tableau IV) ont été choisis sur la base des résultats d’analyse de leur réactivité par immunofluorescence (titre IF-SRAS), vis-à-vis de cellules infectées par le SARS-CoV.

Tableau IV: Sérums testés en ELISA

2) Méthode

[0252] La protéine N (100 €l) diluée à différentes concentrations dans du tampon carbonate 0,1 M, pH 9,6 (1, 2 ou 4 €g/ml) est distribuée dans les puits de plaques ELISA, puis les plaques sont incubées une nuit à température du laboratoire. Les plaques sont lavées avec du tampon PBS-Tween, saturées avec du tampon PBS-lait écrémé-saccharose (5 %). Les sérums à tester (100 €l) préalablement dilués (1/50, 1/100, 1/200, 1/400, 1/800, 1/1600 et 1/3200) sont ajoutés, puis les plaques sont incubées 1 h à 37° C. Après 3 lavages, le conjugué anti-IgG humaines marqué à la peroxydase (référence 209-035-098, JACKSON) dilué au 1/18000 est ajouté puis les plaques sont incubées 1h à 37 °C. Après 4 lavages, le chromogène (TMB) et le substrat (H202) sont ajoutés et les plaques sont incubées 30min à température ambiante, à l’abri de la lumière. La réaction est ensuite arrêtée puis l’absorbance à 450 nm est mesurée à l’aide d’un lecteur automatique.

3) Résultats

[0253] Les tests ELISA (figure 10) démontrent que la préparation de protéine N recombinante est reconnue spécifi- quement par les anticorps de sérums de patients atteints de SRAS prélevés en phase tardive de l’infection (≥ 17 jours après le début des symptômes) alors qu’elle n’est pas reconnue de façon significative par les anticorps d’un sérum de patient prélevé en phase précoce de l’infection (3 jours après le début des symptômes) ni par des sérums témoins de sujets non atteints de SRAS.

Exemple 7 : Tests ELISA élaborés pour une détection très spécifique et sensible d’une infection par le coro- navirus associé au SRAS, à partir de sérums de patients.           

1) Test ELISA IgG indirect

a Réactifs

Préparation des plaques

[0254] Les plaques sont sensibilisées par une solution de protéine N à 2€g/mL dans un tampon PBS 10mM pH 7,2, rouge de phénol à 0,25mL /L. 100 €L de solution sont déposés dans les puits et laissés incubés à température ambiante pendant une nuit. La saturation se fait par un prélavage en tampon PBS 10mM / tween 0,1%, suivi d’un lavage avec une solution de saturation PBS, 25% lait /saccharose.

Diluant serums

[0255] Tampon TRIS 0,48g/L, PBS 10mM, EDTA 3,7g/L,lait 15% v/v , pH 6,7

Diluant conjugué

[0256] Tampon citrate (15g/L), tween 0,5% , sérum bovin 25%, NaCl 12%, lait écrémé 6% v/v PH 6,5

Conjugué

[0257] Conjugué anti-IgG humaines 50X, commercialisés par Bio-Rad : kit Platelia H. pylori ref 72778

Autres solutions :

[0258] Solution de lavage R2, Solutions de révélation au TMB R8 diluant, R9 chromogène, R10 solution d’arrêt : réactifs commercialisés commercialisées par Bio-Rad (ex : kit Platelia pylori, ref 72778)

b) Mode opératoire

[0259] Diluer les serums au 1/200 dans le diluant échantillons
Distribuer 100€L/puits
Incubation 1h à 37°C
3 lavages en solution de LAVAGE R2 10x préalablement diluée 10 fois en eau déminéralisée (i.e., solution de lavage 1X)

Distribuer 100€L de conjugué (conjugué 50x à diluer extemporanément dans le diluant conjugué fourni) Incubation 1h à 37°C
4 lavages en solution de lavage 1X
distribuer 200€L/puits de solution de révélation (à diluer extemporanément ex: mL de R9 dans 10mL de R8) Incubation 30 min à température ambiante à l’obscurité

arrêter la réaction avec 100€L/puits de R10 LECTURE à 450/620nm

[0260] Les résultats peuvent être interprétés en prenant un sérum SEUIL donnant une réponse au delà de laquelle les serums testés seront considérés comme positifs. Ce sérum est choisi et dilué de façon à donner un signal signifi- cativement supérieur au bruit de fond.

2) Test ELISA DOUBLE EPITOPE

a Réactifs

Préparation des plaques

[0261] Les plaques sont sensibilisées par une solution de protéine N à 1€g/mL dans un tampon PBS 10mM pH 7,2, rouge de phénol à 0,25mL /L. 100 €L de solution sont déposés dans les puits et laissés incubés à température ambiante pendant une nuit. La saturation se fait par un prélavage en tampon PBS 10mM / O,1% tween suivi d’un lavage avec une solution de saturation PBS 10mM, lait 25% (V/V)

Diluant serums et conjugué

[0262] Tampon TRIS saline 50mMpH8, lait 2%

Conjugué

[0263] Il s’agit de la protéine N recombinante purifiée, couplée à la peroxidase selon le protocole de Nakane (Nalcane P.K. and Kawaoi A; (1974) : Peroxydase-labeled antibody, a new method of conjugation. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry Vol22, N)23, pp 1084-1091.), dans des ratios molaires respectifs 1/2. Ce conjugué ProtN POD est utilisé à une concentration de 2€g/mL dans du diluant serum/conjugué.

Autres solutions :

[0264] Solution de lavage R2, Solutions de révélation au TMB R8, diluant, R9 chromogène, R10 solution d’arrêt : réactifs commercialisées par Bio-Rad (ex kit platelia pylori ref 72778).

1. b) Mode opératoire
   1ere étape en plaque de « prédilution » [0265]

s Diluer chaque sérum au 1/5 dans la plaque de prédilution (48 €L de diluant +12 €L de sérum). s Après avoir dilués l’ensemble des serums, distribuer 60€L de conjugué
s Le cas échéant, le mélange sérum + conjugué est laissé à incuber.

2eme étape en plaque de « réaction »

[0266]

s Transférer 100€Lde mélange/puits dans la plaque de réaction
s Incubation 1h 37°C
s 5 lavages en solution de LAVAGE R2 10x préalablement diluée 10 fois en eau déminéralisée (–> solution de lavage 1x)
s distribuer 200€L/puits de solution de révélation (à diluer extemporanément ex:l mL de R9 dans 10mL de R8)
s incubation 30min à température ambiante à l’abri de la lumière
s arrêter la réaction avec 100€L/puits de R10
s LECTURE à 450/620nm

[0267] De même que pour le test ELISA indirect, les résultats peuvent être interprétés en utilisant un serum « valeur seuil ». Tout serum ayant une réponse supérieure au sérum valeur seuil sera considéré comme positif.

2) Résultats

[0268] Les sérums de patients classés comme cas probables de SRAS de l’hôpital français de Hanoi, Vietnam ou en relation avec l’hôpital français de Hanoi (JYK) ont été analysés en utilisant le test IgG-N indirect et le test N double épitope. [0269] Les résultats du test IgG-N indirect (figures 14 et 15) et N double épitope (figures 16 et 17) montrent une excellente corrélation entre eux ainsi qu’avec un test ELISA indirect comparant la réactivité des sérums vis-à-vis d’un lysat de cellules VeroE6 non infectées ou infectées par le SRAS-CoV (ELISA-lysat SRAS-CoV ; voir le Tableau V ci- après). Tous les sérums prélevés 12 jours ou plus après le début des symptômes ont été trouvés positifs, y compris chez des patients pour lesquels l’infection par le virus du SRAS-CoV n’avait pas pu être documentée par analyse de prélèvements respiratoires par RT-PCR, vraisemblablement en raison d’un prélèvement trop tardif au cours de l’infection (≥ J12). Dans le cas du patient TTH pour lequel un prélèvement nasal réalisé à J7 a été trouvé négatif par RT-PCR, la qualité du prélèvement pourrait être en cause.

[0270] Certains sérums ont été trouvés négatifs alors que la présence de SRAS-CoV a été détectée par RT-PCR. Il s’agit dans tous les cas de sérums précoces prélevés moins de 10 jours après le début des symptômes (ex : sérum # 032637). Dans le cas d’un patient PTTH (sérum # 032673), seule une suspicion de SRAS était évoquée au moment où les prélèvements ont été réalisés.

[0271] En conclusion, les tests sérologiques IgG-N indirect et N-double épitope permettent de documenter l’infection par le SRAS-CoV chez tous les patients pour des sérums prélevés 12 jours ou plus après l’infection.

Tableau V : Résultats des tests ELISA

Exemple 8 : Détection du coronavirus associé au SRAS (SARS-CoV) par RT-PCR

1) Mise au point de conditions de RT-PCR en temps réel à l’aide d’amorces spécifiques du gène de la protéine de nucléocapside – test « Light Cycler N »

a) conception des amorces et des sondes

[0272] La conception des amorces et sondes a été réalisée à partir de la séquence du génome de la souche de SARS- CoV issue du prélèvement répertorié sous le numéro 031589, à l’aide du programme « Light Cycler Probe Design (Roche) ». Ainsi les deux séries d’amorces et de sondes suivantes ont été sélectionnées :

– série 1 (SEQ ID NO : 60, 61, 64, 65): [0273]

• –  amorce sens : N/+/28507 : 5’-GGC ATC GTA TGG GTT G-3’ [28507-28522]
• –  amorce antisens : N/-/28774 : 5’-CAG TTT CAC CAC CTC C-3’ [28774-28759]
• –  sonde 1 : 5’-GGC ACC CGC AAT CCT AAT AAC AAT GC-fluorescéine 3’ [28561-28586]
• –  sonde 2 : 5’ Red705 -GCC ACC GTG CTA CAA CTT CCT-phosphate [28588-28608]
• –  série 2 (SEQ ID NO : 62, 63, 66, 67) [0274]
  • –  amorce sens : N/+/28375 : 5’-GGC TAC TAC CGA AGA G-3’ [28375-28390]
  • –  amorce antisens : N/-/28702 : 5’-AAT TAC CGC GAC TAC G-3’ [28702-28687]
  • –  sonde 1 : SRAS/N/FL : 5’-ATA CAC CCA AAG ACC ACA TTG GC – fluorescéine 3’ [28541-28563]
  • –  sonde 2 : SRAS/N/LC705 : 5’ Red705 -CCC GCA ATC CTA ATA ACA ATG CTG C-phosphate 3’ [28565-28589]

b) analyse de l’efficacité des deux couples amorces

[0275] Afin de tester l’efficacité respective des deux couples d’amorces, une amplification par RT-PCR a été réalisée sur un ARN synthétique correspondant aux nucléotides 28054-29430 du génome de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le numéro 031589et contenant la séquence du gène N.

[0276] De manière plus précise :

Cet ARN synthétique a été préparé par transcription in vitro à l’aide de l’ARN polymérase du phage T7, d’une matrice d’ADN obtenu par linéarisation du plasmide SRAS-N avec l’enzyme Bam H1. Après élimination de la matrice d’ADN par digestion à l’aide de DNAse 1, les ARN synthétiques sont purifiés par une extraction au phénol-chloroforme suivie de deux précipitations successives en acétate d’ammonium et isopropanol. Ils sont alors quantifiés par mesure de l’absorbance à 260 nm et leur qualité est contrôlée par le rapport des absorbances à 260 et 280 nm ainsi que par une électrophorèse en gel d’agarose. Ainsi, la concentration de la préparation d’ARN synthétique utilisée pour ces études est de 1,6 mg/ml, ce qui correspond à 2,1.1015 copies/ml d’ARN.

[0277] Des quantités décroissantes d’ARN synthétique ont été amplifiés par RT-PCR à l’aide du kit « SuperscriptTM One-Step RT-PCR with Platinum® Taq » et les couples d’amorces n° 1 (N/+/28507, N/-/28774) (figure 1A) et n° 2 (N/+/ 28375, N//28702) (figure 1B), en suivant les indications du fournisseur. Les conditions d’amplification utilisées sont les suivantes : l’ADNc a été synthétisé par incubation 30 min à 45 °C, 15 min à 55°C puis 2 min à 94 °C puis il a été amplifié par 5 cycles comprenant : une étape de dénaturation à 94°C pendant 15 sec, une étape d’hybridation à 45°C pendant 30 sec puis une étape d’élongation à 72°C pendant 30 sec, suivis de 35 cycles comprenant : une étape de dénaturation à 94°C pendant 15 sec, une étape d’hybridation à 55°C pendant 30 sec puis une étape d’élongation à 72°C pendant 30 sec, avec 2 sec d’élongation supplémentaire à chaque cycle, et d’une étape finale d’élongation à 72°C pendant 5 min. Les produits d’amplification obtenus ont ensuite été maintenus à 10°C.

[0278] Les résultats présentés à la figure 11 montrent que le couple d’amorces n° 2 (N/+/28375, N/-/28702) permet de détecter jusqu’à 10 copies d’ARN (bande de faible intensité) ou 102 copies (bande de bonne intensité) contre 104 copies pour le couple d’amorces n° 1 (N/+/28507, N/-/28774). Les amplicons sont respectivement de 268 pb (couple 1) et de 328 pb (couple 2).

c) mise au point de la RT-PCR en temps réel

[0279] Une RT-PCR en temps réel a été mise au point à l’aide du couple d’amorces n°2 et du couple de sonde constitué par SRAS/N/FL et SRAS/N/LC705 (figure 2).

[0280] L’amplification a été réalisée sur un LightCyclerTM (Roche) à l’aide du kit « Light Cycler RNA Amplification Kit Hybridization Probes  » (référence 2 015 145, Roche) dans les conditions optimisées suivantes. Un Mélange réactionnel contenant : H2O (6,8 €l), MgCl2 25 mM (0,8 €l, 4 €M final de Mg2+), mélange réactionnel 5X (4 €l), sonde SRAS/N/FL 3 €M (0,5 €l, 0,075 €M final), sonde SRAS/N/LC705 3 €M (0,5 €l, 0,075 €M final), amorce N/+/28375 10 €M (1 €l, 0,5 €M final), amorce N/-/28702 10 €M (1 €l, 0,5 €M final), mélange d’enzyme (0,4 €l) et échantillon (ARN viral, 5 €l) a été amplifié en suivant le programme suivant :

• –  Transcription inverse : 50°C 10:00min analysis mode: none
• –  Dénaturation : 95°C 30sec x1 analysis mode: none
• –  Amplification : 95°C 2sec }

50°C . 15sec analysis mode: quantification*} x45

72°C 13sec rampe thermique 2,0°C/sec }

• –  refroidissement : 40°C 30sec x1 analysis mode: none

*La mesure de fluorescence se fait à la fin de l’hybridation et à chaque cycle (en mode SINGLE).

[0281] Les résultats présentés à la figure 12 montrent que cette RT-PCR en temps réel est très sensible puisqu’elle permet de détecter 102 copies d’ARN synthétique dans 100% des 5 échantillons analysés (29/29 échantillons dans 8 expériences) et jusqu’à 10 copies d’ARN dans 100% des 5 échantillons analysés (40/45 échantillons dans 8 expériences). Elle montre également que cette RT-PCR permet de détecter la présence du génome du SARS-CoV dans un échantillon et de quantifier le nombre de génomes présents. A titre d’exemple, l’ARN viral d’un stock de SARS-CoV cultivé sur cellules Vero E6 a été extrait à l’aide du kit « Qiamp viral RNA extraction » (Qiagen), dilué à 0,05.10-4 et analysé par RT- PCR en temps réel selon le protocole décrit ci-dessus; l’analyse présentée à la figure 12 montre que ce stock de virus contient 6,5.109 génomes -équivalents/ml (geq/ml), ce qui est tout à fait similaire à la valeur de 1,0.1010 geq/ml mesurée à l’aide du kit « RealArtTM HPA-Coronavirus LC RT PCR Reagents » commercialisé par Artus.

2) Mise au point de conditions de RT-PCR nichée ciblant le gène de l’ARN polymérase – test « RT-PCR nichée CDC (Centers for Disease Control and Prevention) /IP »

a) Extraction de l’ARN viral

[0282] Echantillon clinique : QIAamp viral RNA Mini Kit (QIAGEN) selon les indications du fabricant, ou une technique

équivalente. L’ARN est élué dans un volume de 60 €l.

b) RT-PCR nichée « SNE/SAR »

Première étape : RT-PCR couplée « SNE »

[0283] Le kit Invitrogen « SuperscriptTM One-Step RT-PCR with Platinum® Taq »a été utilisé, mais le kit « Titan » de Roche Boehringer peut lui être substitué avec des résultats similaires.

Oligonucléotides :

[0284]

–  SNE-S1 5’ GGT TGG GAT TAT CCA AAA TGT GA 3’

–  SNE-AS1 5’GCA TCA TCA GAA AGA ATC ATC ATG 3’

=> Taille attendue :440 pb

1. Préparer un mix :

H2O                                          6,5 µl

Reaction mix 2X                       12,5 µl

Oligo SNE-S1 50 µM                0,2 µl

Oligo SNE-AS1 50 µM             0,2 µl

RNAsin 40 U/ µl                       0,12 µl

RT/Platinum Taq mix               0, 5 µl

2. A 20 €l du mix, ajouter 5 €l d’ARN et procéder à l’amplification sur thermocycleur (conditions ABI 9600) :

Conservation à +4°C.

[0285]  La RNAsin (N2511/N2515) de Promega a été utilisée comme inhibiteurs de RNase.

[0286]  Des ARN synthétiques ont servi de témoin positif. A titre de contrôle, 103, 102 et 10 copies d’ARN synthétique

RSNE ont été amplifiées dans chaque expérience.

Seconde étape : PCR nichée « SAR »

Oligonucléotides :

[0287]

• –  SAR1-S 5’ CCT CTC TTG TTC TTG CTC GCA 3’
• –  SAR1-AS 5’ TAT AGT GAG CCG CCA CAC ATG 3’

=> Taille attendue : 121 pb

1. Préparer un mix :

L’AmpliTaq DNA Pol d’Applied Biosystems a été utilisée (tampon 10X sans MgCl2, réf 27216601).

2. A 48 µl du mix, ajouter 2 €l du produit de la première PCR et procéder à l’amplification (conditions ABI 9600) :

                                    suite 

      72°C 30 sec. + 1sec./cycle }

2.4. 72°C             5 min.

2.5 10°C                 ∞

Tableau VI: Analyse par RT-PCR en temps réel des ARN extraits d’une série de prélèvements de 5 patients à l’aide des couples d’amorces et de sondes de la série n° 2 (N « série 2 ») ou du kit « LightCycler SARS-CoV quantification kit » (Roche). Le type de prélèvement est indiqué ainsi que le nombre de copies de génome viral mesurées dans chacun des deux tests. NEG : RT-PCR négative.

b) Deuxième étude comparative

[0289] Les performances de différentes méthodes de RT-PCR nichée et de RT-PCR en temps réel ont ensuite été comparées pour 121 prélèvements respiratoires de cas possibles de SRAS de l’hôpital français de Hanoi, Vietnam, réalisés entre le 4ème et le 17ème jour après le début des symptômes. Parmi ces prélèvements, 14 avaient été trouvés positifs lors d’un premier test utilisant la méthode de RT-PCR nichée ciblant l’ORFlb (codant pour la réplicase) telle que décrite initialement par le Bernhard Nocht Institute (RT-PCR nichée BNI). Des informations concernant ce test sont disponibles sur internet, à l’adresse http://wwwl5.bni-hamburg.de/bnilbn12/neu2/getfile.acgi?area_engl=diagnos- tics&pid=4112.

[0290] Les différents tests comparés dans cette étude sont :

• –  la méthode de RT-PCR quantitative selon l’invention, avec les amorces et sonde N « série 2 » décrite ci-dessus (colonne Light Cycler N),
• –  le test de RT-PCR nichée ciblant le gène de l’ARN polymérase décrit ci-dessus, développé par le CDC, le BNI et l’Institut Pasteur (RT-PCR nichée CDC/IP),
• –  le kit ARTUS de référence « HPA Corona LC RT-PCR Kit # 5601-02 », qui est un test de RT-PCR en temps réel ciblant le gène ORF1b,
• –  le test de RT-PCR nichée du BNI, ciblant également le gène de l’ARN polymérase, mentionné ci-dessus.

[0291] Les inventeurs ont constaté :

1) une variabilité inter-test pour une même technique, liée à la dégradation de la préparation d’ARN lors de décon- gélations répétées, notamment pour les échantillons contenant les quantités d’ARN les plus faibles,
2) une sensibilité réduite de la RT-PCR nichée CDC/IP par rapport à la RT-PCR nichée BNI, et
3) une sensibilité comparable du test de RT-PCR quantitative selon l’invention (Light Cycler N) par rapport au test Light Cycler (LC) Artus.

[0292] Ces résultats, présentés dans le Tableau VII ci-dessous, montrent que le test par RT-PCR quantitative selon l’invention constitue un excellent complément – ou une alternative – aux tests actuellement disponibles. En effet, le coronavirus lié au SRAS est un virus émergent, susceptible d’évoluer rapidement. En particulier, le gène de la RNA polymérase du coronavirus lié au SRAS, qui est ciblé dans la plupart des tests actuellement disponibles, peut recombiner avec celui d’autres coronavirus non liés au SRAS. L’utilisation d’un test ciblant exclusivement ce gène pourrait alors conduire à l’obtention de faux négatifs.

[0293] Le test par RT-PCR quantitative selon l’invention ne cible pas la même région génomique que le kit ARTUS, puisqu’il cible le gène codant pour la protéine N. En réalisant un test de diagnostique ciblant deux gènes différents du coronavirus lié au SRAS, on peut donc espérer s’affranchir de résultats de type faux négatifs, qui pourraient être dus à l’évolution génétique du virus.

[0294] De plus, il apparaît particulièrement avantageux de cibler le gène de la protéine de nucléocapside, car il est très stable, du fait de la forte pression de sélection liée aux contraintes structurales élevées concernant cette protéine.

Tableau VII: Comparaison de différentes méthodes d’analyse par amplification génique, à partir de 121 Prélèvements de cas probables de SRAS de l’hôpital français de Hanoi, Vietnam (épidémie 2003)

Exemple 9 : Obtention et caractérisation d’anticorps monoclonaux dirigés contre la protéine N

[0295] Des souris Balb C ont été immunisées à l’aide de la protéine N recombinante purifiée et leurs cellules spléniques fusionnées avec un myélome murin approprié selon les techniques de Köhler et Milstein.

[0296] Dix-neuf hybridomes sécréteurs d’anticorps anti N ont été présélectionnés et leurs immuno réactivités précisées. Ces anticorps reconnaissent bien la protéine N recombinante (en ELISA) avec des intensités variables, ainsi que la protéine virale, naturelle N en ELISA et/ou en Western Blot. Les figures 18 à 20 montrent les résultats de ces tests pour 15 de ces 19 anticorps monoclonaux.

[0297] Les clones 12, 17, 28, 57, 72, 76, 86, 87, 98, 103, 146, 156, 166, 170, 199, 212, 218, 219 et 222, fortement réactifs, ont été sous clonés. Les études de spécificité ont été poursuivies avec les outils appropriés afin de préciser les épitopes reconnus et vérifier l’absence de réactivité vis-à-vis des autres Coronavirus humains et de certains virus respiratoires.

[0298] Les études de cartographie (mapping) épitopique (réalisées sur membrane spot, à l’aide de peptides chevau- chants de 15 aa) et les études supplémentaires réalisées sur la protéine N naturelle en Western Blot ont révélé l’existence de 4 groupes d’anticorps monoclonaux :

1° Anticorps monoclonaux spécifiques d’un épitope linéaire majeur en position N-ter (75-81, séquence : INTNSVP) Le représentant de ce groupe est l’anticorps 156. L’hybridome produisant cet anticorps a été déposé à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l’Institut Patseur (Paris, France) le 1er décembre 2004, sous le numéro I-3331. Ce même épitope est également reconnu par un sérum de lapin (polyclonal anti N) obtenu par immunisation classique à l’aide de cette même protéine N.

2° Anticorps monoclonaux spécifiques d’un épitope linéaire majeur situé en position centrale (position 217-224, séquence : ETALALL); les représentants de ce groupe sont les anticorps monoclonaux 87 et 166. L’hybridome produisant l’anticorps 87 a été déposé à la CNCM le 1er décembre 2004, sous le numéro I-3328.
3° Anticorps monoclonaux spécifiques d’un épitope linéaire majeur situé en position C-terminale (position 403-408, séquence : DFFRQL), les représentants de ce groupe sont les anticorps 28, 57 et 143. L’hybridome produisant l’anticorps 57 a été déposé à la CNCM le 1er décembre 2004, sous le numéro I-3330.

4° Anticorps monoclonaux spécifiques d’un épitope discontinu, conformationel. Ce groupe d’anticorps ne reconnaît aucun des peptides recouvrant la séquence de la protéine N, mais réagissent fortement sur la protéine naturelle non dénaturée. Le représentant de ce dernier groupe est l’anticorps 86. L’hybridome produisant cet anticorps a été déposé à la CNCM le 1er décembre 2004, sous le numéro I-3329.

[0299] Le Tableau VIII ci-après résume les résultats de cartographie épitopique obtenus :

Tableau VIII : Mapping épitopique des anticorps monoclonaux

[0300] En outre, comme illustré notamment aux figures 18 et 19, ces anticorps ne présentent pas de réactivité en ELISA et/ou en WB, vis à vis de la protéine N du coronavirus humain 229 E.

Exemple 10 : Combinaisons des anticorps monoclonaux pour le développement d’un test d’immunocapture sensible et spécifique de l’antigène viral N dans le sérum ou les fluides biologiques des patients contaminés par le virus SARS Co V

[0301] Les anticorps listés ci-dessous ont été retenus en raison de leurs propriétés bien particulières pour une étude supplémentaire de capture et détection de la protéine virale N, dans le sérum des sujets ou patients.

[0302] Ces anticorps ont été produits en ascite sur souris, purifiés par chromatographie d’affinité et utilisés seuls ou en combinaison comme anticorps de capture, et comme anticorps signal.

[0303] Liste des anticorps sélectionnés pour le propos :

• –  Acm anti région C-ter (n° 28, 57, 143)
• –  Acm anti région centrale (n° 87, 166)
• –  Acm anti région N-ter (n° 156)
• –  Acm anti épitope discontinu, conformationnel (86)

1) Préparation des réactifs :

a) Plaques ELISA immunocapture

[0304] Les plaques sont sensibilisées avec les solutions d’anticorps à 5 €g/ml en tampon carbonate 0,1 M, pH.9,6.

Les solutions (monovalentes ou plurivalentes) sont déposées sous volume de 100 €l dans les puits et incubées pendant une nuit à température ambiante. Ces plaques sont ensuite lavées en tampon PBS (10 mM pH 7,4 additionné de 0,1% de Tween 20) puis saturées avec une solution de PBS additionnée de 0,3% de BSA et de 5% de Saccharose). Les plaques sont ensuite séchées puis conditionnées dans un sachet en présence d’un dessicant. Elles sont prêtes à l’emploi.

b) Conjugués

[0305] Les anticorps purifiés ont été couplés à la péroxydase selon le protocole de Nakane (Nakane et al. – 1974, J.of Histo and cytochemistry, vol.22, p1084-1091) dans un rapport de une molécule d’IgG pour 3 molécules de péroxydase. Ces conjugués ont été purifiés par chromatographie d’exclusion et conservés concentrés (concentration comprise entre 1 à 2 mg/ml) en présence de 50% de glycerol et à -20°C. Ils sont dilués pour leur mise en oeuvre dans les essais à la concentration finale de 1 ou 2 €g/ml en tampon PBS (pH 7,4) additionné de 1% de BSA.

1. c) Autres réactifs

[0306]

• –  Sérums humains négatifs pour tous les marqueurs sériques des virus HIV, HBV, HCV et THLV
• –  Pool de sérums humains négatifs additionné de 0,5% de Triton X 100
• –  Ag viral inactivé : surnageant de culture virale inactivé par irradiation et inactivation vérifiée après mise en culture

sur cellules sensibles – titre de la suspension avant inactivation environ 107 particules infectieuses par ml ou encore

environ 5×109 particules virales physiques par ml d’antigène

• –  Les échantillons d’Ag dilués en sérum humain négatif : ces échantillons ont été préparés par dilution au 1:100e puis

par dilution en série de raison 5.
Ces échantillons non infectieux miment des échantillons humains supposés contenir des concentrations faibles à très faibles de nucléoprotéine virale N. De tels échantillons ne sont pas accessibles pour les travaux de routine

• –  Solution de lavage R2, solution de révélation TMB R8, chromogène R9 et solution d’arrêt R10, sont les réactifs génériques commercialisés par Bio-Rad dans ses trousses ELISA (ex : trousse Platelia Pylori ref.72778).

2) Mode opératoire

[0307] Les échantillons de sérums humains surchargés en Ag viral inactivé sont distribués à raison de 100 €l par cupule, directement dans les plaques sensibilisées, prêtes à l’emploi puis incubés pendant 1 heure à 37°C (incubation Bio-Rad IPS).

[0308] Le matériel non retenu par la phase solide est éliminé par 3 lavages (lavage avec solution R2 diluée, laveur automatique LP 35).

[0309] Les conjugués appropriés, dilués à la concentration finale de 1 ou 2 €g/ml sont distribués à raison de 100 €l par cupule et les plaques incubées à nouveau pendant une heure à 37° C (incubation IPS).

[0310]  L’excès de conjugué est éliminé par 4 lavages successifs (solution R2 diluée – laveur LP 35).

[0311]  La présence de conjugué fixé sur les plaques est révélée après addition de 100 €l de solution de révélation

préparée avant emploi (1 ml de R9 et 10 ml de R8) et après incubation pendant 30 minutes, à température ambiante et à l’abri de la lumière.

[0312] La réaction enzymatique est finalement bloquée par addition de 100 €l de réactif R10 (H2SO4 IN) dans toutes les cupules.

[0313]  La lecture est effectuée à l’aide d’un lecteur de microplaque approprié à double longueur d’onde (450/620 nm).

[0314]  Les résultats peuvent être interprétés en utilisant comme valeur seuil provisoire la moyenne d’au moins deux

contrôles négatifs multiplié par un facteur 2 ou encore la moyenne de 100 sérums négatifs additionnée d’un incrément correspondant à 6 SD (Standart Deviation calculée sur les 100 mesures individuelles).

3) Résultats

[0315] Différentes combinaisons anticorps de capture et anticorps signal ont été testées en se fondant sur les propriétés des anticorps sélectionnés, et en évitant les combinaisons d’anticorps spécifiques des mêmes épitopes en phase solide et en conjugués.

[0316] Les meilleurs résultats ont été obtenus avec les 4 combinaisons listées ci-dessous. Ces résultats sont reproduits dans le tableau IX ci-après.

1. Combinaison F/28 Phase solide (Acm 166 + 87 région centrale) : conjugué anticorps 28 (C-ter)
2. Combinaison G/28
   Phase solide (Acm 86 – épitope conformationel) : conjugué anticorps 28 (C-ter)                                                     
3. Combinaison H/28                                                                              Phase solide (Acms 86, 166 et 87 région centrale et épitope conformationel) : conjugué anticorps 28 (C-ter)        
4. Combinaison H/28 + 87
   Phase solide (Acms 86, 166 et 87 région centrale et épitope conformationel) : conjugué mixte anticorps 28 (C-ter) et 87 (central)
5. Combinaison G/87
   Phase solide (Acm 86 – épitope conformationel) : conjugué anticorps 87 (région centrale). Les 4 premières combinaisons présentent des performances équivalentes et reproduites, supérieures aux autres combinaisons mises en oeuvre (comme par exemple la combinaison G/87). Bien entendu, dans ces combinaisons, un anticorps monoclonal peut être remplacé par un autre anticorps reconnaissant le même épitope. Ainsi, on peut citer les variantes suivantes :
6. Variante de la combinaison F/28
   Phase solide (Acm 87 uniquement) : conjugué anticorps 57 (C-ter)
7. Variante de la combinaison G/28
   Phase solide (Acm 86 – épitope conformationel) : conjugué anticorps 57 (C-ter)
8. Variante de la combinaison H/28
   Phase solide (Acms 86 et 87 région centrale et épitope conformationel) : conjugué anticorps 57 (C-ter)
9. Variante de la combinaison H/28 + 87
   Phase solide (Acms 86 et 87 région centrale et épitope conformationel) : conjugué mixte anticorps 57 (C-ter) et 87 (central)

Tableau IX : Contrôle d’immunoréactivité des Acm anti nucléoprotéines SARS CoV : densités optiques mesurées avec chaque combinaison d’anticorps, en fonction des dilutions de l’antigène viral inactivé.

[0317] La limite de détection de ces 4 essais expérimentaux correspond à la dilution d’antigène en sérum négatif 1: 62500. Une extrapolation rapide laisse supposer la détection de moins de 103 particules infectieuses par ml de sérums.

[0318] De cette étude, il ressort que les anticorps les mieux appropriés pour la capture de la nucleoprotéine virale native sont les anticorps spécifiques de la région centrale et/ou d’un épitope conformationnel, l’un et l’autre étant des anticorps sélectionnés également pour leur forte affinité pour l’antigène natif.

[0319] Ayant déterminé les meilleurs anticorps pour la composition de la phase solide, les anticorps à retenir en priorité pour la détection des antigènes fixés sur la phase solide, sont les anticorps complémentaires spécifiques d’un épitope dominant en région C-ter. L’emploi de tout autre anticorps complémentaire, mais spécifique des épitopes localisés en région N-ter de la protéine conduit à des résultats moyens ou médiocres.

Exemple 11 : Systèmes d’expression eucaryotes de la proteine de spicule (S) du coronavirus associé au SRAS (SRAS-CoV)

1) Optimisation des conditions d’expression de la S du SRAS-CoV en cellules de mammifères.

[0320] Les conditions d’expression transitoire de la protéine de spicule (S) du SRAS-CoV ont été optimisées en cellules de mammifères (293T, VeroE6).

[0321] Pour cela, un fragment d’ADN contenant le cDNA de la S du SRAS-CoV a été amplifié par PCR à l’aide des oligonucléotides 5’-ATAGGATCCA CCATGTTTAT TTTCTTATTA TTTCTTACTC TCACT-3’ et 5’-ATACTCGAGTT AT- GTGTAATG TAATTTGACA CCCTTG-3’ à partir du plasmide pSARS-S (C.N.C.M. n° I-3059) puis inséré entre les sites BamH1 et Xho1 du plasmide pTRIP∆U3-CMV contenant un vecteur lentiviral TRIP (Sirven, 2001, Mol. Ther., 3, 438-448) pour obtenir le plasmide pTRIP-S. Le fragment BamH1 et Xho1 contenant le cDNA de la S a ensuite été sous-cloné entre les BamH1 et Xho1 du plasmide d’expression eucaryote pcDNA3.1(+) (Clontech) pour obtenir le plasmide pcDNA- S. Le fragment Nhe1 et Xho1 contenant le cADN de la S a ensuite été sous-cloné entre les sites correspondants du plasmide d’expression pCI (Promega) pour obtenir le plasmide pCI-S. Les séquences WPRE du virus de l’hépatite de la marmotte (« Woodchuck Hepatitis Virus posttranscriptional regulatory element ») et les séquences CTE (« constitutive transport element ») du rétrovirus simien de Mason-Pfizer ont été insérées dans chacun des deux plasmides pcDNA-S et pCI-S entre les sites Xho1 et Xba1 pour obtenir respectivement les plasmides pcDNA-S-CTE, pcDNA-S-WPRE, pCI- S-CTE et pCI-S-WPRE (figure 21). Le plasmide pCI-S-WPRE a été déposé à la CNCM, le 22 novembre 2004, sous le numéro I-3323. Tous les inserts ont été séquencés à l’aide d’un kit BigDye Terminator v1.1 (Applied Biosystems) et d’un séquenceur automatique ABI377.

[0322] La capacité des plasmides construits à diriger l’expression de la S du SRAS-CoV dans des cellules de mam- mifères a été recherchée après transfection de cellules VeroE6 (figure 22). Dans cette expérience, des monocouches de 5×105 cellules VeroE6 en boites de Pétri de 35mm ont été transfectées avec 2 €g des plasmides pcDNA (à titre de contrôle), pcDNA-S, pCI et pCI-S et 6 €l de réactif Fugene6 selon les indications du fabricant (Roche). Après 48 heures d’incubation à 37°C et sous 5% de CO2, des extraits cellulaires ont été préparé en tampon de dépôt selon Laemmli, séparés sur un gel SDS à 8% de polyacrylamide, puis transférés sur une membrane de PVDF (BioRad). La détection de cette immunoempreinte (« western blot ») a été réalisée à l’aide d’un sérum polyclonal de lapin anti-S (immun-sérum du lapin P11135 : cf exemple 4 ci-dessus) et d’anticorps polyclonaux d’âne dirigés contre les IgG de lapin et couplés à la peroxidase (NA934V, Amersham). Les anticorps fixés ont été révélés par luminescence à l’aide du kit ECL+ (Amers- ham) et de films d’autoradiographie Hyperfilm MP (Amersham).

[0323] Cette expérience (figure 22) montre que le plasmide pcDNA-S ne permet pas de diriger l’expression de la S du SRAS-CoV à des niveaux détectables tandis que le plasmide pCI-S permet une expression faible, proche de la limite de détection, qui peut être mise en évidence lorsque le film est surexposé. Des résultats similaires ont été obtenus lorsque l’expression de la S a été recherchée par immunofluorescence (données non montrées). Cette impossibilité de détecter une expression efficace de la S ne peut pas être imputée aux techniques de détection utilisées puisque la protéine S peut être mise en évidence à la taille attendue (180 kDa) dans un extrait de cellules infectées par le SRAS- CoV ou dans un extrait de cellules VeroE6 infectées par le virus recombinant de la vaccine VV-TF7.3 et transfectées par le plasmide pcDNA-S. Dans cette dernière expérience, le virus VV-TF7.3 exprime l’ARN polymérase du phage T7 et permet la transcription cytoplasmique d’un ARN non coiffé susceptible d’être traduit efficacement. Cette expérience suggère que les défauts d’expression décrits ci-dessus sont dus à une incapacité intrinsèque du cADN de la S à être exprimé efficacement lorsque l’étape de transcription en ARN messager est réalisée au niveau nucléaire.

[0324] Dans une seconde expérience, l’effet des signaux CTE et WPRE sur l’expression de la S a été recherchée après transfection de cellules VeroE6 (figure 23A) et 293T (figure 23B) et selon un protocole similaire à celui décrit ci- dessus. Alors que l’expression de la S ne peut pas être mis en évidence après transfection des plasmides pcDNA-S- CTE et pcDNA-S-WPRE dérivés de pcDNA-S, l’insertion des signaux WPRE et CTE améliore fortement l’expression de la S dans le contexte du plasmide d’expression pCI-S.

[0325] Pour préciser ce résultat, une deuxième série d’expériences a été réalisée, où l’immunoempreinte est révélée de façon quantitative par luminescence et acquisition sur un dispositif d’imagerie numérique (FluorS, BioRad). L’analyse des résultats obtenus avec le logiciel QuantityOne v4.2.3 (BioRad) montre que les séquences WPRE et CTE augmentent respectivement l’expression de la S d’un facteur 20 à 42 et 10 à 26 en cellules Vero E6 (Tableau X). En cellules 293T (Tableau X), l’effet de la séquence CTE est plus modéré (4 à 5 fois) tandis que celui de la séquence WPRE reste important (13 à 28 fois).

Tableau X analyse quantitative de l’effet des signaux CTE et WPRE sur l’expression de la S du SRAS-CoV :

Des extraits cellulaires ont été préparés 48 heures après transfection de cellulesVeroE6 ou 293T par les plasmides pCI, pCI-S, pCI-S-CTE et pCI-S-WPRE et analysés par western blot comme décrit dans la légende de la figure 22. Le western blot est révélé par luminescence (ECL+, Amersham) et acquisition sur un dispositif d’imagerie numérique (FluorS, BioRad). Les niveaux d’expression sont indiqués en fonction d’une échelle arbitraire où la valeur de 1 représente le niveau mesuré après transfection du plasmide pCI-S. Deux expériences indépendantes ont été réalisées pour chacun des deux types cellulaires. Dans l’expérience 1 sur cellules VeroE6, les transfections ont été réalisées en dupliqués et les résultats sont indiqués sous la forme de moyennes et écart-types des niveaux d’expression mesurées.

[0326] En résumé, l’ensemble de ces résultats montre que l’expression dans des cellules de mammifères du cADN de la S du SRAS-CoV sous la dépendance de séquences promotrices de l’ARN polymérase II, requiert, pour être efficace, la présence d’un signal d’épissage ainsi que de l’une ou l’autre des séquences WPRE et CTE.

2) Obtention de lignées stables permettant l’expression de la S du SRAS-CoV

[0327] Le cADN de la protéine S du SRAS-CoV a été cloné sous la forme d’un fragment BamH1-Xho1 dans le plasmide pTRIP∆U3-CMV contenant un vecteur lentiviral défectif TRIP à DNA flap central (Sirven et al, 2001, Mol. Ther., 3 : 438-448) pour obtenir le plasmide pTRIP-S (figure 24). La co-transfection transitoire selon Zennou et al (2000, Cell, 101 : 173-185) de ce plasmide, d’un plasmide d’encapsidation (p8.2) et d’un plasmide d’expression de la glycoprotéine d’enveloppe G du VSV (pHCMV-G) dans des cellules 293T a permis la préparation de pseudoparticules rétrovirales contenant le vecteur TRIP -S et pseudotypées par la protéine d’enveloppe G. Ces vecteurs TRIP-S pseudotypés ont été utilisés pour transduire des cellules 293T et FRhK-4 : aucune expression de la protéine S n’a pu être mis en évidence par western blot et immunofluorescence dans les cellules transduites (données non présentées).

[0328] Les cassettes d’expression optimales constituées du promoteur immédiat/précoce du virus CMV, d’un signal d’épissage, du cDNA de la S et de l’un ou l’autre des signaux post-transcriptionnels WPRE ou CTE décrites ci-dessus ont alors été substituées à la cassette EF1á-EGFP du vecteur d’expression lentiviral défectif à DNA FLAP central TRIP∆U3-EF1á (Sirven et al, 2001, Mol. Ther., 3 :438-448) (figure 25). Ces substitutions ont été réalisées par une série de sous-clonages successifs des cassettes d’expression de S qui ont été excisées des plasmides pCT-S-CTE (Bg1II- Apa1) ou respectivement pCI-S-WPRE (BgIII-Sall) puis insérées entre les sites Mlu1 et Kpn1 ou respectivement Mlu1 et Xho1 du plasmide TRIP∆U3-EF1á pour obtenir les plasmides pTRIP-SD/SA-S-CTE et pTRIP-SD/SA-S-WPRE, dé- posés à la CNCM, le 1er décembre 2004, sous les numéros I-3336 et I-3334, respectivement. Des vecteurs pseudotypés ont été produits selon Zennou et al (2000, Cell, 101 : 173-185) et utilisés pour transduire des cellules 293T (10000 cellules) et FRhK-4 (15000 cellules) selon une série de 5 cycles successifs de transduction avec une quantité de vecteur correspondant à 25 ng (TRIP-SD/SA-S-CTE) ou 22 ng TRIP-SD/SA-S-WPRE) de p24 par cycle.

[0329] Les cellules transduites ont été clonées par dilution limite et une série de clones ont été analysés pour l’ex- pression de la S du SRAS-CoV qualitativement par immunofluorescence (données non montrées), puis quantitativement par western blot (figure 25) à l’aide d’un sérum polyclonal de lapin anti-S. Les résultats présentés dans la figure 25 montrent que les clones 2 et 15 de cellules FrhK4-s-CTE transduites par TRIP-SD/SA-S-CTE et les clones 4, 9 et 12 de cellules FRhK4-S-WPRE transduites par TRIP-SD/SA-S-WPRE permettent l’expression de la S du SRAS-CoV à des niveaux respectivement faibles et modérés si on les compare à ceux que l’on peut observer au cours de l’infection par le SRAS-CoV.

[0330] En résumé, les vecteurs TRIP-SD/SA-S-CTE et TRIP-SD/SA-S-WPRE permettent l’obtention de clones stables de cellules FRhK-4 et de façon similaire 293T exprimant la S du SRAS-CoV, alors que les essais réalisés avec le vecteur « de base » TRIP-S sont restés infructueux, ce qui démontre la nécessité d’un signal d’épissage ainsi que de l’une, ou l’autre, des séquences CTE et WPRE pour l’obtention de clones cellulaires stables exprimant la protéine S.
[0331] En outre, ces modifications du vecteur TRIP (insertion d’un signal d’épissage et d’un signal post-transcriptionnel comme CTE et WPRE) pourraient s’avérer intéressantes pour améliorer l’expression d’autres cDNA que celui de la S.

3) Obtention de lignées stables permettant l’expression d’une forme soluble de la S du SRAS-CoV. Purification de cet antigène recombinant

[0332] Un cDNA codant pour une forme soluble de la protéine S (Ssol) a été obtenu en fusionnant les séquences codant pour l’ectodomaine de la protéine (acides aminés 1 à 1193) à celles d’une étiquette (FLAG : DYKDDDDK) via un linker BspEl codant pour le dipeptide SG. Pratiquement, pour obtenir le plasmide pcDNA-Ssol, un fragment d’ADN codant pour l’ectodomaine de la S du SRAS-CoV a été amplifié par PCR à l’aide des oligonucléotides 5’-ATAGGATCCA CCATGTTTAT TTTCTTATTA TTTCTTACTC TCACT-3’ et 5’-ACCTCCGGAT TTAATATATT GCTCATATTT TCCCAA- 3’ à partir du plasmide pcDNA-S, puis inséré entre les sites uniques BamH1 et BspEl uniques d’un plasmide d’expression eucaryote pcDNA3.1(+) (Clontech) modifié contenant entre ses sites BamH1 et Xho1 la séquence de l’étiquette FLAG :

[0333] Les fragments Nhe1-Xho1 et BamH1-Xho1, contenant le cADN de la S, ont ensuite été excisés du plasmide pcDNA-Sso1, et sous-clonés entre les sites correspondants du plasmide pTRIP-SD/SA-S-CTE et du plasmide pTRIP- SD/SA-S-WPRE, respectivement, pour obtenir les plasmides pTRIP-SD/SA-Ssol-CTE et pTRIP-SD/SA-Ssol-WPRE, déposés à la CNCM, le 1er décembre 2004, sous les numéros I-3337 et I-3335, respectivement.

[0334] Des vecteurs pseudotypés ont été produits selon Zennou et coll. (2000, Cell, 101 : 173-185) et utilisés pour transduire des cellules FRhK-4 (15000 cellules) selon une série de 5 cycles successifs de transduction (15000 cellules) avec une quantité de vecteur correspondant à 24 ng (TRIP-SD/SA-Ssol-CTE) ou 40 ng TRIP-SD/SA-Ssol-WPRE) de p24 par cycle. Les cellules transduites ont été clonées par dilution limite et une série de 16 clones transduits par TRIP- SD/SA-Ssol-CTE et de 15 clones par TRIP-SD/SA-Ssol-WPRE ont été analysés pour l’expression du polypeptide Ssol par western blot révélé par un anticorps monoclonal anti-FLAG (figure 26 et données non montrées), ainsi que par un ELISA-capture spécifique du polypeptide Ssol qui a été mis au point dans ce but (Tableau XI et données non montrées). Une partie du processus de sélection des meilleurs clones sécréteurs est montré dans la figure 26. L’ELISA-capture repose sur l’utilisation de phases solides recouvertes d’anticorps polyclonaux de lapins immunisés par du SRAS-CoV purifié et inactivé. Ces phases solides permettent la capture du polypeptide Ssol sécrété dans les surnageants cellulaires, dont la présence est ensuite révélée par une série d’étapes impliquant successsivement la fixation d’un anticorps monoclonal anti-FLAG (M2, SIGMA), d’anticorps biotinylés polyclonaux de lapin anti-IgG(H+L) de souris (Jackson) et d’un conjugué streptavidine-peroxidase (Amersham) puis l’addition de chromogène et de substrat (TMB + H202, KPL).

Tableau XI : analyse de l’expression de polypeptide Ssol par des lignées cellulaires transduites par les vecteurs lentiviraux TRIP-SD/SA-Ssol-WPRE et TRIP-SD/SA-Ssol-CTE.

La sécrétion du polypeptide Ssol a été recherchée dans le surnageant d’une série de clones cellulaires isolés après transduction de cellules FRhK-4 par les vecteurs lentiviraux TRIP-SD/SA-Ssol-WPRE et TRIP-SD/SA-Ssol-CTE. Les surnageants dilués au 1/50 ont été analysés par un test ELISA-capture spécifique de la S du SRAS-CoV.

[0335] La lignée cellulaire sécrétant les quantités les plus élevées de polypeptide Ssol dans le surnageant de culture est la lignée FRhK4-Ssol-CTE3. Elle a été soumise à une deuxième série de 5 cycles de transduction par le vecteur TRIP-SD/SA-Ssol-CTE dans des conditions similaires à celles décrites ci-dessus puis clonée. Le sous-clone sécrétant les quantités les plus élevés de Ssol a été sélectionné par une combinaison d’analyse par western blot et ELISA-capture : il s’agit du sous-clone FRhK4-Ssol-30, qui a été déposé à la CNCM, le 22 novembre 2004, sous le numéro I-3325.

[0336] La lignée FRhK4-Ssol-30 permet la production et la purification en quantité du polypeptide recombinant Ssol. Dans une expérience type où les conditions expérimentales de croissance, de production et de purification ont été optimisées, les cellules de la lignée FRhK4-Ssol-30 sont ensemencées en milieu de culture standard (DMEM sans pyruvate contenant 4.5g/l de glucose et supplémenté par 5% de SVF, 100 U/ml de pénicilline et 100 €g/ml de strepto- mycine) sous la forme d’une monocouche sous-confluente (1 million de cellules pour chaque 100 cm2 dans 20 ml de milieu). A confluence, le milieu standard est remplacé par le milieu de sécrétion où la quantité de SVF est abaissée à 0.5% et la quantité de milieu réduite à 16 ml pour chaque 100 cm2. Le surnageant de culture est prélevé après 4 à 5 jours d’incubation à 35°C et sous 5% de CO2. Le polypeptide recombinant Ssol est purifié à partir du surnageant par l’enchaînement d’étapes de filtration sur membrane de polyethersulfone (PES) de 0.1 €m, de concentration par ultra- filtration sur une membrane de PES de point de coupure 50kD, de chromatographie d’affinité sur matrice anti-FLAG avec élution par une solution de peptide FLAG (DYKDDDDK) à 100 €g/ml en TBS (Tris 50mM pH 7.4, 150 mMNaCl) puis de chromatographie de gel filtration en TBS sur billes de sephadex G-75 (Pharmacia). La concentration du poly- peptide recombinant Ssol purifié a été déterminée par test micro-BCA (Pierce) puis ses caractéristiques biochimiques analysées.

[0337] L’analyse par gel SDS à 8 % d’acrylamide coloré au nitrate d’argent met en évidence un polypeptide majoritaire dont la masse moléculaire est d’environ 180kD et dont le degré de pureté peut être évalué à 98% (figure 27A). Par spectrométrie de masse SELDI-TOF (Cyphergen), deux pics principaux sont mis en évidence : ils correspondent à des formes simplement, et doublement chargées d’un polypeptide majoritaire dont la masse moléculaire est ainsi déterminée à 182,6 % 3,7 kD (figures 27B et C). Après transfert sur membrane Prosorb et rincage en TFA 0,1%, l’extrémité N- terminale du polypeptide Ssol a été séquencée en phase liquide par dégradation d’Edman sur 5 résidus (ABI494, Applied Biosystems) et déterminée comme étant SDLDR (figure 27D). Ceci démontre que le peptide signal localisé à l’extrémité N-terminale de la protéine S du SRAS-CoV, composé des aa 1 à 13 (MFIFLLFLTLTSG) d’après une analyse réalisée avec le logiciel signalP v2.0 (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering, 10 : 1-6), est clivé du polypeptide Ssol mature. Le polypeptide recombinant Ssol est donc constitué des acides aminés 14 à 1193 de la protéine S du SRAS-CoV fusionnés en C-terminal à une séquence SGDYKDDDDK contenant la séquence de l’étiquette FLAG (soulignée). L’écart entre la masse molaire théorique du polypeptide Ssol nu (132,0 kD) et la masse molaire réelle du polypeptide mature (182,6 kD) suggère que le polypeptide Ssol est glycosylé.

[0338] Une préparation de polypeptide Ssol purifié et dont la concentration protéique a été déterminée par test micro- BCA, permet de réaliser une gamme étalon pour mesurer à l’aide du test ELISA-capture décrit plus haut les concentrations de Ssol présent dans les surnageants de culture et de revisiter les caractéristiques des lignées sécrétrices. Selon ce test, la lignée FRhK4-Ssol-CT3 sécrète 4 à 6 €g/ml de polypeptide Ssol tandis que la lignée FRhK4-Ssol-30 sécrète 9 à 13 €g/ml de Ssol après 4 à 5 jours de culture à confluence. En outre, le schéma de purification présenté plus haut permet en routine de purifier de 1 à 2 mg de polypeptide Ssol par litre de surnageant de culture.

Exemple 12 : Immunisation génique visant la proteine de spicule (S) du coronavirus associé au SRAS (SRAS- CoV)

[0339] L’effet d’un signal d’épissage et des signaux post-transcriptionnels WPRE et CTE a été analysé après immu- nisation génique de souris BALB/c (figure 28).

[0340] Pour cela, des souris BALB/c ont été immunisées à des intervalles de 4 semaines par injection dans le tibialis anterior d’une solution saline de 50 €g d’ADN plasmidique de pcDNA-S et pCI-S ainsi que, à titre de contrôle, par 50 €g d’ADN plasmidique de pcDNA-N (dirigeant l’expression de la N du SRAS-CoV) ou de pCI-HA (dirigeant l’expression de la HA du virus grippal A/PR/8/34) et les sérums immuns collectés 3 semaines après la 2ème injection. La présence d’anticorps dirigés contre la S du SRAS-CoV a été recherchée par ELISA indirect en utilisant comme antigène un lysat de cellules VeroE6 infectées par le SRAS-CoV et à titre de contrôle, un lysat de cellules VeroE6 non infectées. Les titres (TI) en anticorps anti-SRAS-CoV sont calculés comme l’inverse de la dilution produisant une DO spécifique de 0,5 (différence entre DO mesurée sur lysat de cellules infectées et DO mesurée sur lysat de cellules non infectées) après révélation par un anticorps polyclonal anti-IgG de souris couplé à la peroxidase (NA931V, Amersham) et du TMB additionné de H2O2 (KPL) (figure 28A).

[0341] Dans ces conditions, le plasmide d’expression pcDNA-S ne permet l’induction que de faibles titres d’anticorps dirigées contre la S du SRAS-CoV chez 3 souris sur 6 (LOG10(TI)=1,9%0,6) alors que le plasmide pcDNA-N permet l’induction d’anticorps anti-N à des titres élevés (LOG10(TI)= 3,9%0,3) chez tous les animaux, et les plasmides contrôles (pCI, pCI-HA) n’entraînent aucun anticorps détectable (LOG10(TI)<1,7). Le plasmide pCI-S muni d’un signal d’épissage permet l’induction d’anticorps à des titres élevés (LOG10(TI)= 3,7%0,2), qui sont environ 60 fois supérieurs à ceux observés après injection du plasmide pcDNA-S (p<10-5).

[0342] L’efficacité des signaux post-transcriptionnels a été étudiée en réalisant une étude dose-réponse des titres en anticorps anti-S induits chez la souris BALB/c en fonction de la quantité d’ADN plasmidique utilisé comme immunogène (2€g, 10 €g et 50 €g). Cette étude (figure 28B) démontre que le signal post-transcriptionnel WPRE améliore fortement l’efficacité de l’immunisation génique lorsque de faibles doses d’ADN sont utilisées (p<10-5 pour une dose de 2 €g d’ADN et p<10-2 pour une dose de 10 €g), alors que l’effet du signal CTE reste marginal (p=0,34 pour une dose de 2 €g d’ADN).

[0343] Enfin, les anticorps induits chez la souris après immunisation génique neutralisent l’infectivité du SRAS-CoV in vitro (figures 29A et 29B) à des titres qui sont en rapport avec les titres mesurés par ELISA.

[0344] En résumé, l’utilisation d’un signal d’épissage et du signal post-transcriptionnel WPRE du virus de l’hépatite de la marmotte améliore de façon considérable l’induction d’anticorps neutralisants dirigés contre le SRAS-CoV après immunisation génique à l’aide d’ADN plasmidique dirigeant l’expression du cADN de la S du SRAS-CoV.

Exemple 13 : Applications diagnostiques de la protéine S

[0345] La réactivité en ELISA du polypeptide recombinant Ssol a été analysée vis-à-vis de sérums de patients atteints de SRAS.

[0346] Les sérums de cas probables de SRAS testés ont été choisis sur la base des résultats (positifs ou négatifs) d’analyse de leur réactivité spécifique vis-à-vis des antigènes natifs du SRAS-CoV par test d’immunofluorescence sur cellules VeroE6 infectées par le SRAS-CoV et/ou par test ELISA indirect en utilisant comme antigène un lysat de cellules VeroE6 infectées par le SRAS-CoV. Les sérums de ces patients sont identifiés par un numéro d’ordre du Centre National de Référence des Virus Influenzae ainsi que par les initiales du patient et le nombre de jours écoulés depuis le début des symptomes. Tous les sérums de cas probables (cf Tableau XII) reconnaissent les antigènes natifs du SRAS-CoV, à l’exception du sérum 032552 du patient VTT, pour lequel l’infection par le SRAS-CoV n’a pas pu être confirmée par RT-PCR réalisée sur prélèvements respiratoires des jours 3, 8 et 12. Un panel de sérums témoin a été utilisé à titre de contrôle (sérums TV): il s’agit de sérums prélevés en France avant l’épidémie de SRAS survenue en 2003.

Tableau XII : sérums de cas probables de SRAS

[0347] Des phases solides sensibilisées par le polypeptide recombinant Ssol ont été préparées par adsorption d’une solution de polypeptide Ssol purifié à 2 €g/ml en PBS dans les puits d’une plaque ELISA, puis les plaques sont incubées une nuit à 4°C et lavées avec du tampon PBS-Tween (PBS, 0,1% Tween20). Après saturation des plaques ELISA par une solution de PBS-lait écrémé à 10% (poids/volume) et lavage en PBS-tween, les sérums à tester (100 €l) sont dilués au 1/400 dans du tampon PBS-lait écrémé-Tween (PBS, 3% lait écrémé, 0,1% Tween) puis ajoutés dans les puits de la plaque ELISA sensibilisée. Les plaques sont incubées 1h à 37°C. Après 3 lavages avec du tampon PBS-Tween, le conjugué anti-IgG humaines marqué à la peroxidase (réf NA933V, Amersham) dilué au 1/4000 dans du tampon PBS- lait écrémé-Tween est ajouté, puis les plaques sont incubées une heure à 37°C. Après 6 lavages avec du tampon PBS- Tween, le chromogène (TMB) et le substrat (H2O2) sont ajoutés et les plaques sont incubées 10 minutes à l’abri de la lumière. La réaction est arrêtée par ajout d’une solution 1N de H3PO4, puis l’absorbance est mesurée à 450 nm avec un référence à 620nm.

[0348] Les tests ELISA (figure 30) démontrent que le polypeptide recombinant Ssol est reconnu spécifiquement par les anticorps sériques de patients atteints de SRAS prélevés en phase moyenne ou tardive de l’infection (≥ 10 jours après le début des symptômes alors qu’il n’est pas reconnu de façon significative par les anticorps sériques de deux patients (JLB et JCM) prélevés en phase précoce de l’infection (3 à 8 jours après le début des symptômes) ni par des sérums témoins de sujets non atteints de SRAS. Les anticorps sériques des patients JLB et JCM montrent une séro- conversion entre les jours 3 et 27 pour le premier et 8 et 29 pour le second après le début des symptômes, ce qui confirme la spécificité de la réactivité de ces sérums vis-à-vis du polypeptide Ssol.

[0349] En conclusion, ces résultats démontrent que le polypeptide recombinant Ssol peut être utilisé comme antigène pour la mise au point d’un test ELISA de diagnostic sérologique de l’infection par le SRAS-CoV.

Exemple 14 : Applications vaccinales de la protéine S soluble recombinante

1. [0350]  L’immunogénicité du polypeptide recombinant Ssol a été étudiée chez la souris.
2. [0351]  Pour cela, un groupe de 6 souris a été immunisé à 3 semaines d’intervalle avec 10 €g de polypeptide recom-

binant Ssol adjuvé par 1 mg d’hydroxyde d’aluminium (Alu-gel-S, Serva) dilué en PBS. Trois immunisations successives ont été réalisées et les sérums immuns ont été prélevés 3 semaines après chacune des immunisations (IS1, IS2, IS3). A titre de contrôle, un groupe de souris (groupe mock) a reçu de l’hydroxide d’aluminium seul selon le même protocole. [0352] Les sérums immuns ont été analysés par pool pour chacun des 2 groupes par ELISA indirect en utilisant un lysat de cellules VeroE6 infectées par le SRAS-CoV comme antigène et à titre de contrôle, un lysat de cellules VeroE6 non infectées. Les titres en anticorps anti-SRAS-CoV sont calculés comme l’inverse de la dilution produisant une DO spécifique de 0,5 après révélation par un anticorps polyclonal anti-IgG(H+L) de souris couplé à la peroxidase (NA931 V, Amersham) et du TMB additionné de H2O2 (KPL). Cette analyse (figure 31) montre que l’immunisation par le poly- peptide Ssol induit chez la souris dès la première immunisation des anticorps dirigés contre la forme native de la protéine de spicule du SRAS-CoV présente dans le lysat de cellules VeroE6 infectées. Après 2 puis 3 immunisations, les titres en anticorps anti-S deviennent très élevés.
[0353] Les sérums immuns ont été analysés par pool pour chacun des 2 groupes pour leur capacité à séroneutraliser l’infectivité du SRAS-CoV. 4 points de séroneutralisation sur cellules FRhK-4 (100 TCID50 de SRAS-CoV) sont réalisés pour chacune des dilutions de raison 2 testées à partir du 1/20. Le titre séroneutralisant est calculé selon la méthode de Reed et Munsch comme l’inverse de la dilution neutralisant l’infectivité de 2 cupules sur 4. Cette analyse montre que les anticorps induits chez la souris par le polypeptide Ssol sont neutralisants : les titres observés sont très élevés après 2 puis 3 immunisations (supérieurs à 2560 et 5120 respectivement, Tableau XIII).

Tableau XIII : induction d’anticorps dirigés contre le SRAS-CoV après immunisation avec le polypeptide recombinant Ssol.

Les sérums immuns ont été analysés par pool pour chacun des 2 groupes pour leur capacité à séroneutraliser l’infectivité de 100 TCID50 du SRAS-CoV sur cellules FRhK-4. 4 points sont réalisés pour chacune des dilutions de raison 2 testées à partir du 1/20. Le titre séroneutralisant est calculé selon la méthode de Reed et

Munsch comme l’inverse de la dilution neutralisant l’infectivité de 2 cupules sur 4.

[0354] Les titres neutralisants observés chez les souris immunisées avec le polypeptide Ssol atteignent des niveaux très supérieurs aux titres observés par Yang et coll. chez la souris (2004, Nature, 428: 561-564) et à ceux observés par Buchholz chez le hamster (2004, PNAS 101 : 9804-9809), qui protègent respectivement la souris et le hamster de l’infection par le SRAS-CoV. Il est donc vraisemblable que les anticorps neutralisants induits chez la souris après immunisation par le polypeptide Ssol protègent ces animaux contre l’infection par le SRAS-CoV.

Exemple 15 : Gène synthétique optimisé pour l’expression en cellules de mammifères de la protéine de spicule (S) du coronavirus associé au SRAS (SRAS-CoV).

1) Conception du gène synthétique

[0355] Un gène synthétique codant pour la protéine de spicule du SRAS-CoV a été conçu à partir du gène de l’isolat 031589 (plasmide pSARS-S, C.N.C.M. n° I-3059) de façon à permettre des niveaux d’expression élevés dans des cellules de mammifères et en particulier dans les cellules d’origine humaine.

[0356] Pour cela :

• –  l’usage des codons du gène sauvage de l’isolat 031589 a été modifié de façon à se rapprocher du biais observé chez l’homme et à améliorer l’efficacité de traduction du mRNA correspondant
• –  le contenu global en GC du gène a été augmenté de façon à prolonger la demi-vie du mRNA correspondant
• –  les motifs, éventuellement cryptiques, susceptibles d’interférer avec une expression efficace du gène ont été sup- primés (sites donneurs et accepteurs d’épissage, signaux de polyadénylation, séquences très riches (>80%) ou très pauvres (<30%) en GC, séquences répétées, séquences impliquées dans la formation de structures secondaires de l’ARN, boites TATA)
• –  un deuxième codon STOP a été ajouté pour permettre une terminaison efficace de la traduction.

[0357] En outre, des motifs CpG ont été introduits dans le gène de façon à augmenter son immunogénicité comme vaccin à ADN. Afin de faciliter la manipulation du gène synthétique, deux sites de restriction BamH1 et Xho1 ont été placés de part et d’autre de la phase ouverte de lecture de la protéine S, et les sites de restriction BamH1, Xho1, Nhe1, Kpn1, BspEl et Sal1 ont été évités dans le gène synthétique.

[0358]  La séquence du gène synthétique conçu (gène 040530) est donnée en SEQ ID No: 140.

[0359]  Un alignement du gène synthétique 040530 avec la séquence du gène sauvage de l’isolat 031589 du SRAS-CoV déposé à la C.N.CM. sous le numéro I-3059 (SEQ ID NO : 4, plasmide pSRAS-S) est présenté dans la figure 32.

2) Constructions plasmidiques

[0360] Le gène synthétique SEQ ID No: 140 a été assemblé à partir d’oligonucléotides synthétiques et cloné entre les sites Kpn1 et Sac1 du plasmide pUC-Kana pour donner le plasmide 040530pUC-kana. La séquence nucléotidique de l’insert du plasmide 040530pUC-kana a été vérifiée par séquençage automatique (Applied).

[0361] Un fragment Kpn1-Xho1 contenant le gène synthétique 040530 a été excisé du plasmide 040530pUC-kana et sous-cloné entre les sites Nhe1 et Xho1 du plasmide d’expression pCI (Promega) pour obtenir le plasmide pCI-SSYNTH, déposé à la CNCM le 1er décembre 2004, sous le numéro I-3333.

[0362] Un gène synthétique codant pour la forme soluble de la protéine S a ensuite été obtenu en fusionnant les séquences synthétiques codant pour l’ectodomaine de la protéine S (acides aminés 1 à 1193) à celles de l’étiquette (FLAG : DYKDDDDK) via un linker BspEl codant pour le dipeptide SG. Pratiquement, un fragment d’ADN codant pour l’ectodomaine de la S du SRAS-CoV a été amplifié par PCR à l’aide des oligonucléotides 5’-ACTAGCTAGC GGATC- CACCA TGTTCATCTT CCTG -3’ et 5’- AGTATCCGGAC TTGATGTACT GCTCGTACTT GC-3’ à partir du plasmide 040530pUC-kana, digéré par Nhe1 et BspEl puis inséré entre les sites uniques Nhe1 et BspEl du plasmide pCI-Ssol, pour donner le plasmide pCI-SCUBE, déposé à la CNCM le 1er décembre 2004, sous le numéro 1-3332. (Les plasmides pCI-Ssol, pCI-Ssol-CTE et pCI-Ssol-WPRE (déposé à la CNCM, le 22 novembre 2004, sous le numéro I-3324) avaient été précédemment obtenus par sous-clonage du fragment Kpn1-Xho1 excisé du plasmide pcDNA-Ssol (voir note tech- nique de la DI 2004-106) entre les sites Nhe1 et Xho1 des plasmides pCI, pCI-S-CTE et pCI-S-WPRE respectivement.)

[0363] Les plasmides pCI-Scube et pCI-Ssol codent pour le même polypeptide recombinant Sso1.

3) Résultats

[0364] La capacité du gène synthétique codant pour la protéine S à diriger efficacement l’expression de la S du SRAS- CoV dans des cellules de mammifères a été comparée à celle du gène sauvage après transfection transitoire de cellules de primates (VeroE6) et de cellules humaines (293T).

[0365] Dans l’expérience présentée par la figure 33 et au Tableau XIV, des monocouches de 5×105 cellules VeroE6 ou 7×105 cellules 293T en boites de Pétri de 35mm ont été transfectées avec 2 €g des plasmides pCI (à titre de contrôle), pCI-S, pCI-S-CTE, pCI-S-WPRE et pCI-Ssynth et 6 €l de réactif Fugene6 selon les indications du fabricant (Roche). Après 48 heures d’incubation à 37°C et sous 5% de CO2, des extraits cellulaires ont été préparés en tampon de dépôt selon Laemmli, séparés sur un gel SDS à 8% de polyacrylamide puis transférés sur une membrane de PVDF (BioRad). La détection de cette immunoempreinte (« western blot ») a été réalisée à l’aide d’un sérum polyclonal de lapin anti-S (immun-sérum du lapin P11135 : cf exemple 4 ci-dessus) et d’anticorps polyclonaux d’âne dirigés contre les IgG de lapin et couplés à la peroxidase (NA934V, Amersham). L’immunoempreinte est révélée de façon quantitative par lumi- nescence à l’aide du kit ECL+ (Amersham) et acquisition sur un dispositif d’imagerie numérique (FluorS, BioRad).

[0366] L’analyse des résultats obtenus avec le logiciel QuantityOne v4.2.3 (BioRad) montre que dans cette expérience, le plasmide pCI-Synth permet l’expression transitoire de la protéine S à des niveaux élevés dans les cellules VeroE6 et 293T, alors que le plasmide pCI-S ne permet pas d’induire une expression à des niveaux suffisants pour être détectée. Les niveaux d’expression observés sont de l’ordre de 2 fois supérieurs à ceux observés avec le plasmide pCI-S-WPRE.

Tableau XIV : utilisation d’un gène synthétique pour l’expression de la S du SRAS-CoV.

Des extraits cellulaires préparés 48 heures après transfection de cellulesVeroE6 ou 293T par les plasmides pCI, pCI-S, pCI-S-CTE, pCI-S- WPRE et pCI-Ssynth ont été séparés sur un gel SDS à 8% d’acrylamide et analysés par western blot à l’aide d’un anticorps polyclonal de lapin anti-S et d’un anticorps polyclonal anti-IgG(H+L) de lapin couplé à la peroxidase (NA934V, Amersham). Le western blot est révélé par luminescence (ECL+, Amersham) et acquisition sur un dispositif d’imagerie numérique (FluorS, BioRad). Les niveaux d’expression de la protéine S ont été mesurés en quantifiant les 2 bandes majoritaires repérées sur l’image (voir figure 33) et sont indiqués en fonction d’une échelle arbitraire où la valeur de 1 représente le niveau mesuré après transfection du plasmide pCI-S-WPRE.

[0367] Dans un second temps, la capacité du gène synthétique Scube à diriger efficacement la synthèse et la sécrétion du polypeptide Ssol par des cellules de mammifères a été comparée à celle du gène sauvage après transfection transitoire de cellules de hamster (BHK-21) et de cellules humaines (293T).

[0368] Dans l’expérience présentée par le Tableau XV, des monocouches de 6×105 cellules BHK-21 et de 7×105 cellules 293T en boites de Pétri de 35mm ont été transfectées avec 2 €g des plasmides pCI (à titre de contrôle), pCI- Ssol, pCI-Ssol-CTE, pCI-Ssol-WPRE et pCI-Scube et 6 €l de réactif Fugene6 selon les indications du fabricant (Roche). Après 48 heures d’incubation à 37°C et sous 5% de CO2, les surnageants cellulaires ont été prélevés et analysés de façon quantitative pour la sécrétion du polypeptide Ssol par un test ELISA-capture spécifique du polypeptide Ssol.

[0369] L’analyse des résultats montre que, dans cette expérience, le plasmide pCI-Scube permet l’expression du polypeptide Ssol à des niveaux 8 fois (cellules BHK-21) à 20 fois (cellules 293T) plus élevés que le plasmide pCI-Ssol. Les niveaux d’expression observés sont de l’ordre de 2 fois (cellules 293T) à 5 fois (cellules BHK-21) supérieurs à ceux observés avec le plasmide pCI-Ssol-WPRE.

Tableau XV : utilisation d’un gène synthétique pour l’expression du polypeptide Ssol.

Les surnageants ont été récoltés 48 heures après transfection de cellules BHK ou 293T par les plasmides pCI, pCI-Ssol, pCI-Ssol-CTE, pCI-Ssol-WPRE et pCI-Scube et analysés de façon quantitative pour la sécrétion du polypeptide Ssol par un test ELISA-capture spécifique du polypeptide Ssol. Les transfections ont été réalisées en dupliqués et les résultats sont indiqués sous la forme de moyennes et écart-types des concentrations de polypeptide Ssol (ng/ml) mesurées dans les surnageants.

[0370] En résumé, ces résultats montrent que l’expression dans des cellules de mammifères du gène synthétique 040530 codant pour la S du SRAS-CoV sous la dépendance de séquences promotrices de l’ARN polymérase II est bien plus efficace que celle du gène sauvage de l’isolat 031589. Cette expression est même plus efficace que celle dirigée par le gène sauvage en présence des séquences WPRE du virus de l’hépatite de la marmotte.

4) Applications

[0371] L’utilisation du gène synthétique 040530 codant pour la S du SRAS-CoV ou de sa variante Scube codant pour le polypeptide Ssol est susceptible de remplacer avantageusement le gène sauvage dans de nombreuses applications où l’expression de la S est nécessaire à des niveaux élevés. En particulier pour :

• –  améliorer l’efficacité de l’immunisation génique par des plasmides du type pCI-Ssynth voire pCI-Ssynth-CTE ou pCI-Ssynth-WPRE
• –  établir de nouvelles lignées cellulaires exprimant des quantités plus élevées de la protéine S ou du polypeptide Ssol à l’aide de vecteurs lentiviraux recombinants porteurs du gène Ssynth ou du gène Scube respectivement
• –  améliorer l’immunogénicité des vecteurs lentiviraux recombinants permettant l’expression de la protéine S ou du polypeptide Ssol
• –  améliorer l’immunogénicité de vecteurs vivants permettant l’expression de la protéine S ou du polypeptide Ssol comme des virus recombinants de la vaccine ou des virus rougeole recombinants (voir exemples 16 et 17 ci-après)

Exemple 16 : Expression de la protéine de spicule (S) du coronavirus associé au SRAS (SRAS-CoV) à l’aide de virus recombinants de la Vaccine.

Application vaccinale.

Application à la production d’une forme soluble de la protéine de spicule (S) et conception d’un test de sérologie du SRAS.

1) Introduction

[0372] Le but de cet exemple est d’évaluer la capacité de virus recombinants de la vaccine (VV) exprimant différents antigènes du coronavirus associé au SRAS (SRAS-CoV) à constituer de nouveaux candidats vaccins contre le SRAS et un moyen de produire des antigènes recombinants en cellules de mammifères.

[0373] Pour cela, les inventeurs se sont intéressés à la protéine de spicule (S) du SRAS-CoV, qui permet d’induire après immunisation génique chez l’animal des anticorps neutralisants l’infectivité du SRAS-CoV, ainsi qu’à une forme soluble et sécrétée de cette protéine, le polypeptide Ssol, qui est composé de l’ectodomaine (aa 1-1193) de la S fusionné en son extrémité C-ter à une étiquette FLAG (DYKDDDDK) via un linker BspEl codant pour le dipeptide SG. Ce polypeptide Ssol présente une antigénicité similaire à celle de la protéine S et permet, après injection à la souris sous la forme d’une protéine purifiée adjuvée en hydroxide d’aluminium, l’induction de titres élevés d’anticorps neutralisants contre le SRAS- CoV.

[0374] Les différentes formes du gène S ont été placées sous la dépendance du promoteur du gène 7.5K puis introduites au sein du locus de la thymidine kinase (TK) de la souche Copenhague du virus de la vaccine par double recombinaison homologue in vivo. Afin d’améliorer l’immunogénicité des virus vaccine recombinants, un promoteur tardif synthétique a été choisi à la place du promoteur 7.5K, pour augmenter la production de S et Ssol au cours des phases tardives du cycle viral.

[0375] Après avoir isolé les virus vaccine recombinants et vérifié leur capacité à exprimer l’antigène S du SRAS-CoV, leur capacité à induire chez la souris une réponse immunitaire contre le SRAS a été testée. Après avoir purifié l’antigène Ssol du surnageant de cellules infectées, un test ELISA de sérodiagnostic du SRAS a été conçu, et son efficacité a été évaluée à l’aide de sérums de cas probables de SRAS.

2) Construction des virus recombinants

[0376] Des virus recombinants de la vaccine dirigeant l’expression de la glycoprotéine S de l’isolat 031589 du SRAS- CoV et d’une forme soluble et sécrétée de cette protéine, le polypeptide Ssol, sous la dépendance du promoteur 7.5K ont été obtenus. Dans le but d’augmenter les niveaux d’expression de S et Ssol, des virus recombinants dans lesquels les cDNA de S et de Ssol sont placés sous la dépendance d’un promoteur synthétique tardif ont également été obtenus.

[0377] Le plasmide pTG186poly est un plasmide de transfert pour la construction de virus recombinants de la vaccine (Kieny, 1986, Biotechnology, 4 :790-795). A ce titre, il contient le gène de la thymidine kinase du VV dans lequel a été inséré le promoteur du gène 7.5K suivi d’un site multiple de clonage permettant l’insertion de gènes hétérologues (figure 34A). Le promoteur du gène 7.5K contient en fait un tandem de deux séquences promotrices actives respectivement durant les phases précoces (PE) et tardives (PL) du cycle de réplication du virus de la vaccine. Les fragments BamH1- Xho1 ont été excisés des plasmides pTRIP-S et pcDNA-Ssol respectivement et insérés entre les sites BamH1 et Sma1 du plasmide pTG186poly pour donner les plasmides pTG-S et pTG-Ssol (figure 34A). Les plasmides pTG-S et pTG- Ssol ont été déposés à la CNCM, le 2 décembre 2004, sous les numéros I-3338 et 1-3339, respectivement.

[0378] Les plasmides pTN480, pTN-S et pTN-Ssol ont été obtenus à partir des plasmides pTG186poly, pTG-S et pTG-Ssol respectivement, en substituant le fragment Nde1-Pst1 contenant le promoteur 7.5K par un fragment d’ADN contenant le promoteur tardif synthétique 480, qui a été obtenu par hybridation des oligonucléotides 5’- TATGAGCTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTGGC ATATAAATAG ACTCGGCGCG CCATCTGCA-3’ et 5’- GATGGCGCGC CGAGTCTATT TATATGCCAA AAAAAAAAAA AAA.AAAAAGC TCA-3’ (figure 34B). L’insert a été séquencé à l’aide d’un kit BigDye Terminator v1.1 (Applied Biosystems) et d’un séquenceur automatique ABI377. La séquence du promoteur synthétique tardif 480 tel que cloné dans les plasmides de transfert de la série pTN est indiquée figure 34C. Les plasmides pTN-S et pTN-Ssol ont été déposés à la CNCM, le 2 décembre 2004, sous les numéros I-3340 et I-3341, respectivement.

[0379] Les virus recombinants de la vaccine ont été obtenus par double recombinaison homologue in vivo entre la cassette TK des plasmides de transfert des séries pTG et pTN et le gène TK de la souche Copenhague du virus de la vaccine selon une procédure décrite par Kieny et coll. (1984, Nature, 312: 163-166). Brièvement, des cellules CV-1 sont transfectées à l’aide de DOTAP (Roche) par de l’ADN génomique de la souche copenhague du virus de la vaccine et chacun des plasmides de transfert des séries pTG et pTN décrits ci-dessus, puis surinfectées par le virus vaccine auxiliaire VV-ts7 pendant 24 heures à 33°C. Le virus auxiliaire est contre-sélectionné par incubation à 40°C pendant 2 jours puis les virus recombinants (phénotype TK-) sélectionnés par deux cycles de clonage sous milieu gélosé sur cellules 143Btk- en présence de BuDr (25 €g/ml). Les 6 virus VV-TG, VV-TG-S, VV-TG-Ssol, VV-TN, VV-TN-S et VV- TN-Ssol ont été respectivement obtenus à l’aide des plasmides de transfert pTG186poly, pTG-S, pTG-Ssol, pTN480, pTN-S, pTN-Ssol. Les virus VV-TG et VV-TN n’expriment aucun gène hétérologue et ont été utilisés comme contrôle TK- dans les expériences. Les préparations de virus recombinants ont été réalisés sur monocouches de cellules CV-1 ou BHK-21 et le titre en unités formant plage (u.f.p.) déterminé sur cellules CV-1 selon Earl et Moss (1998, Current Protocols in Molecular Biology, 16.16.1-16.16.13).

3) Caractérisation des virus recombinants

[0380]  L’expression des transgènes codant la protéine S et le polypeptide Ssol a été recherchée par western blot.

[0381]  Des monocouches de cellules CV-1 ont été infectées à une multiplicité de 2 par les différents virus vaccine recombinants VV-TG, VV-TG-S, VV-TG-Ssol, VV-TN, VV-TN-S et VV-TN-Ssol. Après 18 heures d’incubation à 37°C et sous 5% de CO2, des extraits cellulaires ont été préparés en tampon de dépôt selon Laemmli, séparés sur un gel SDS à 8% de polyacrylamide puis transférés sur une membrane de PVDF (BioRad). La détection de cette immunoem- preinte (« western blot ») a été réalisée à l’aide d’un sérum polyclonal de lapin anti-S (immun-sérum du lapin P11135 : cf exemple 4) et d’anticorps polyclonaux d’âne dirigés contre les IgG de lapin et couplés à la peroxidase (NA934V, Amersham). Les anticorps fixés ont été révélés par luminescence à l’aide du kit ECL+ (Amersham) et de films d’auto- radiographie Hyperfilm MP (Amersham).

[0382] Comme le montre la figure 35A, le virus recombinant VV-TN-S dirige l’expression de la protéine S à des niveaux qui sont comparables à ceux que l’on peut observer 8h après infection par le SRAS-CoV mais qui sont bien plus élevés que ceux que l’on peut observer après infection par W-TG-S. Dans une deuxième expérience (figure 35B), l’analyse de quantités variables d’extraits cellulaires montre que les niveaux d’expression observés après infection par les virus de la série TN (VV-TN-S et VV-TN-Ssol) sont environ 10 fois plus élevés que ceux observés avec les virus de la série TG (VV-TG-S et VV-TG-Ssol respectivement). En outre, le polypeptide Ssol est sécrété dans le surnageant de cellules CV- 1 infectées par le virus VV-TN-Ssol plus efficacement que dans le surnageant de cellules infectées par VV-TG-Ssol (figure 36A). Dans cette expérience, le virus VV-TN-Sflag a été utilisé à titre de contrôle, car il exprime la forme mem- branaire de la protéine S fusionnée en son extrémité C-ter à l’étiquette FLAG. La protéine Sflag n’est pas détectée dans le surnageant des cellules infectées par VV-TN-Sflag, démontrant que le polypeptide Ssol est bien sécrété de façon active après infection par VV-TN-Ssol.

[0383] Ces résultats démontrent que les virus vaccine recombinants sont bien porteurs des transgènes et permettent l’expression de la glycoprotéine du SRAS sous sa forme membranaire (S) ou sous une forme soluble et sécrétée (Ssol). Les virus vaccine porteurs du promoteur synthétique 480 permettent l’expression de S et la sécrétion de Ssol à des niveaux bien plus élevés que les virus porteurs du promoteur du gène 7.5K.

4) Application à la production d’une forme soluble de la S du SRAS-CoV. Purification de cet antigène recom- binant et applications diagnostiques.

[0384] La lignée BHK-21 est la lignée cellulaire qui sécrète les quantités les plus élevées de polypeptide Ssol après infection par le virus VV-TN-Ssol parmi les lignées testées (BHK-21, CV1, 293T et FrhK-4, figure 36B); elle permet la production et la purification en quantité du polypeptide recombinant Ssol. Dans une expérience type où les conditions expérimentales d’infection, de production et de purification ont été optimisées, les cellules BHK-21 sont ensemencées en milieu de culture standard (DMEM sans pyruvate contenant 4.5g/l de glucose et supplémenté par 5% de TPB, 5% de SVF, 100 U/ml de pénicilline et 100 €g/ml de streptomycine) sous la forme d’une monocouche sous-confluente (10 millions de cellules pour chaque 100 cm2 dans 25 ml de milieu). Après 24h d’incubation à 37°C sous 5% de CO2, les cellules sont infectées à une M.O.I. de 0.03 et le milieu standard remplacé par le milieu de sécrétion où la quantité de SVF est abaissée à 0.5% et le TPB supprimé. Le surnageant de culture est prélevé après 2,5 jours d’incubation à 35°C et sous 5% de CO2 et le virus de la vaccine inactivé par addition de triton X-100 (0,1%). Après filtration sur membrane de polyethersulfone (PES) de 0.1 €m, le polypeptide recombinant Ssol est purifié par une chromatographie d’affinité sur matrice anti-FLAG avec élution par une solution de peptide FLAG (DYKDDDDK) à 100 €g/ml en TBS (Tris 50mM pH 7.4, 150 mMNaCl).

[0385] L’analyse par gel SDS à 8 % d’acrylamide coloré au nitrate d’argent a mis en évidence un polypeptide majoritaire dont la masse moléculaire est d’environ 180kD et dont le degré de pureté est supérieur à 90% (figure 37).La concentration du polypeptide recombinant Ssol purifié a été déterminée par comparaison avec les marqueurs de masse moléculaire et estimée à 24 ng/€l.

[0386] Cette préparation de polypeptide Ssol purifié permet de réaliser une gamme étalon pour mesurer à l’aide d’un test ELISA-capture les concentrations de Ssol présentes dans les surnageants de culture. Selon ce test, la lignée BHK- 21 sécrète environ 1 €g/ml de polypeptide Ssol dans les conditions de production décrites plus haut. En outre, le schéma de purification présenté permet de purifier de l’ordre de 160 €g de polypeptide Ssol par litre de surnageant de culture.

[0387] La réactivité en ELISA du polypeptide recombinant Ssol a été analysée vis-à-vis de sérums de patients atteints de SRAS.

[0388] Les sérums de cas probables de SRAS testés ont été choisis sur la base des résultats (positifs ou négatifs) d’analyse de leur réactivité spécifique vis à vis des antigènes natifs du SRAS-CoV par test d’immunofluorescence sur cellules VeroE6 infectées par le SRAS-CoV et/ou par test ELISA indirect en utilisant comme antigène un lysat de cellules VeroE6 infectées par le SRAS-CoV. Les sérums de ces patients sont identifiés par un numéro d’ordre du Centre National de Référence des Virus Influenzae ainsi que par les initiales du patient et le nombre de jours écoulés depuis le début des symptômes. Tous les sérums de cas probables (cf Tableau XVI) reconnaissent les antigènes natifs du SRAS-CoV à l’exception du sérum 032552 du patient VTT, pour lequel l’infection par le SRAS-CoV n’a pas pu être confirmée par RT-PCR réalisée sur prélèvements respiratoires des jours 3, 8 et 12. Un panel de sérums témoin a été utilisé à titre de contrôle (sérums TV): il s’agit de sérums prélevés en France avant l’épidémie de SRAS survenue en 2003.

Tableau XVI : sérums de cas probables de SRAS

[0389] Des phases solides sensibilisées par le polypeptide recombinant Ssol ont été préparées par adsorption d’une solution de polypeptide Ssol purifié à 4 €g/ml en PBS dans les puits d’une plaque ELISA. Les plaques sont incubées une nuit à 4°C puis lavées avec du tampon PBS-Tween (PBS, 0,1% Tween20). Après lavage en PBS-tween, les sérums à tester (100 €l) sont dilués au 1/100 et 1/400 dans du tampon PBS-lait écrémé-Tween (PBS, 3% lait écrémé, 0,1% Tween) puis ajoutés dans les puits de la plaque ELISA sensibilisée. Les plaques sont incubées 1h à 37°C. Après 3 lavages avec du tampon PBS-Tween, le conjugué anti-IgG humaines marqué à la peroxidase (réf NA933V, Amersham) dilué au 1/4000 dans du tampon PBS-lait écrémé-Tween est ajouté puis les plaques sont incubées une heure à 37°C. Après 6 lavages avec du tampon PBS-Tween, le chromogène (TMB) et le substrat (H2O2) sont ajoutés et les plaques sont incubées 10 minutes à l’abri de la lumière. La réaction est arrêtée par ajout d’une solution 1M de H3PO4 puis l’absorbance est mesurée à 450 nm avec une référence à 620nm.

[0390] Les tests ELISA (figure 38) démontrent que le polypeptide recombinant Ssol est reconnu spécifiquement par les anticorps sériques de patients atteints de SRAS prélevés en phase moyenne ou tardive de l’infection (≥ 10 jours après le début des symptômes), alors qu’il n’est pas reconnu de façon significative par les anticorps sériques des sérums témoins de sujets non atteints de SRAS.

[0391] En conclusion, ces résultats démontrent que le polypeptide recombinant Ssol peut être purifié à partir du surnageant de cellules de mammifères infectées par le virus vaccine recombinant W-TN-Ssol et être utilisé comme antigène pour la mise au point d’un test ELISA de diagnostic sérologique de l’infection par le SRAS-CoV.

5) Applications vaccinales

[0392]  L’immunogénicité des virus vaccine recombinants a été étudiée chez la souris.

[0393]  Pour cela, des groupes de 7 souris BALB/c ont été immunisés par voie i.v. à deux reprises à 4 semaines

d’intervalle par 106 u.f.p. de virus vaccine recombinants VV-TG, VV-TG-S, W-TG-Ssol, W-TN, W-TN-S et VV-TN-Ssol ainsi que, à titre de contrôle, VV-TG-HA qui dirige l’expression de l’hémagglutinine de la souche A/PR/8/34 du virus de la grippe. Les sérums immuns ont été prélevés 3 semaines après chacune des immunisations (IS1, IS2).

[0394] Les sérums immuns ont été analysés par pool pour chacun des groupes par ELISA indirect en utilisant un lysat de cellules VeroE6 infectées par le SRAS-CoV comme antigène et à titre de contrôle, un lysat de cellules VeroE6 non infectées. Les titres (TI) en anticorps anti-SRAS-CoV sont calculés comme l’inverse de la dilution produisant une DO spécifique de 0,5 après révélation par un anticorps polyclonal anti-IgG(H+L) de souris couplé à la peroxidase (NA931V, Amersham) et du TMB additionné de H2O2 (KPL). Cette analyse (figure 39A) montre que l’immunisation par le virus VV-TG-S et W-TN-S induit chez la souris dès la première immunisation des anticorps dirigés contre la forme native de la protéine de spicule du SRAS-CoV présente dans le lysat de cellules VeroE6 infectées. Les réponses induites par le virus VV-TN-S sont plus élevées que celles induites par le virus VV-TG-S après la première (TI=740 et TI=270 respec- tivement) et la deuxième (TI=3230 et TI=600 respectivement) immunisation. Le virus VV-TN-Ssol induit de forts titres d’anticorps anti-SRAS-CoV après deux immunisations (TI=640), alors que le virus VV-TG-Ssol induit une réponse à la limite de la détection (TI=40).

[0395] Les sérums immuns ont été analysés par pool pour chacun des groupes pour leur capacité à séroneutraliser l’infectivité du SRAS-CoV. 4 points de séroneutralisation sur cellules FRhK-4 (100 TCID50 de SRAS-CoV) sont réalisés pour chacune des dilutions de raison 2 testées à partir du 1/20. Le titre séroneutralisant est calculé selon la méthode de Reed et Munsch comme l’inverse de la dilution neutralisant l’infectivité de 2 cupules sur 4. Cette analyse montre que les anticorps induits chez la souris par les virus vaccine exprimant la protéine S ou le polypeptide Ssol sont neutralisants et que les virus à promoteurs synthétiques sont des immunogènes plus efficaces que les virus porteurs du promoteur 7.5K : les titres les plus élevés (640) sont observés après 2 immunisations par le virus VV-TN-S (figure 39B).
[0396] Le pouvoir protecteur des anticorps neutralisants induits chez la souris après immunisation par les virus vaccine recombinants est évalué à l’aide d’une infection d’épreuve par le SRAS-CoV.

6) Autres applications

[0397] Des virus vaccine recombinants de troisième génération sont construits en substituant les séquences sauvages des gènes S et Ssol par des gènes synthétiques optimisés pour l’expression en cellules de mammifères, décrits ci- dessus. Ces virus vaccine recombinants sont susceptibles d’exprimer des quantités plus importantes des antigènes S et Ssol et donc de présenter une immunogénicité accrue.

[0398] Le virus vaccine recombinant VV-TN-Ssol peut être utilisé pour la production en quantité et la purification de l’antigène Ssol en vue d’applications diagnostiques (sérologie par ELISA) et vaccinales (vaccin sous-unitaire).

Exemple 17 : Virus recombinant de la rougeole exprimant la protéine de spicule (S) du coronavirus associé au SRAS (SRAS-CoV). Applications vaccinales.

1) Introduction

[0399] Le vaccin rougeole (MV) induit chez l’homme une immunité protectrice de longue durée après une seule injection (Hilleman, 2002, Vaccine, 20 : 651-665). La protection conférée est très robuste et repose sur l’induction d’une réponse en anticorps et d’une réponse cellulaire CD4 et CD8. Le génome du MV est très stable et aucune réversion vers la virulence des souches vaccinales n’a jamais été observée. Le virus de la rougeole appartient au genre des Morbillivirus de la famille des Paramyxoviridae ; c’est un virus enveloppé dont le génome est un ARN monocaténaire de polarité négative de 16kb (figure 40A) et dont le cycle de réplication exclusivement cytoplasmique exclut toute possibilité d’intégration dans le génome de l’hôte. Le vaccin rougeole est ainsi l’un des vaccins vivants les plus efficaces et les plus sûrs utilisés dans la population humaine. L’équipe de Frédéric Tangy a développé récemment un vecteur d’expression sur la base de la souche Schwarz du virus de la rougeole, qui est la souche atténuée la plus sûre et la plus utilisée chez l’homme comme vaccin contre la rougeole. Cette souche vaccinale peut être isolée à partir d’un clone moléculaire infectieux en conservant son immunogénicité chez les primates ainsi que chez la souris susceptible à l’infection. Elle constitue, après insertion d’unités de transcription supplémentaires, un vecteur pour l’expression de séquences hétérologues (Combredet, 2003, J. Virol. 77 : 11546-11554). En outre, un MV Schwarz recombinant exprimant la glycoprotéine d’enveloppe du virus West Nile (WNV) induit une réponse en anticorps efficace et de longue durée qui protège la souris d’une infection d’épreuve létale par le WNV (Despres et al, 2004, J. Infect. Dis., sous presse). Toutes ces caractéristiques font de la souche atténuée Schwarz du virus de la rougeole un candidat vecteur extrêmement prometteur pour la construction de nouveaux vaccins vivants recombinants.

[0400] Le but de cet exemple est d’évaluer la capacité de virus recombinants de la rougeole (MV) exprimant différents antigènes du coronavirus associé au SRAS (SRAS-CoV) à constituer de nouveaux candidats vaccins contre le SRAS.

[0401] Les inventeurs se sont intéressés à la protéine de spicule (S) du SRAS-CoV, qui permet d’induire après immunisation génique chez l’animal des anticorps neutralisants l’infectivité du SRAS-CoV, ainsi qu’à une forme soluble et sécrétée de cette protéine, le polypeptide Ssol, qui est composé de l’ectodomaine (aa 1-1193) de la S fusionné en son extrémité C-ter à une étiquette FLAG (DYKDDDDK) via un linker BspEl codant pour le dipeptide SG. Ce polypeptide Ssol présente une antigénicité similaire à celle de la protéine S et permet, après injection à la souris sous la forme d’une protéine purifiée adjuvée en hydroxide d’aluminium, l’induction de titres élevés d’anticorps neutralisants contre le SRAS- CoV.

[0402] Les différentes formes du gène S ont été introduites sous la forme d’une unité de transcription supplémentaire entre les gènes P (phosphoprotéine) et M (matrice) dans le cADN de la souche Schwarz du MV précédemment décrite (Combredet, 2003, J. Virol. 77 : 11546-11554 ; Demande EP N° 02291551.6 du 20 juin 2002, et Demande EP n° 02291550.8 du 20 juin 2002). Après avoir isolé les virus recombinants MVSchw2-SARS-S et MVSchw2-SARS-Ssol et vérifié leur capacité à exprimer l’antigène S du SRAS-CoV, leur capacité à induire chez la souris puis chez le singe une réponse immunitaire protectrice contre le SRAS est testée.

2) Construction des virus recombinants

[0403] Le plasmide pTM-MVSchw-ATU2 (figure 40B) contient un cADN infectieux correspondant à l’antigénome de la souche vaccinale Schwarz du virus de la rougeole (MV) dans lequel une unité de transcription supplémentaire (ATU) a été introduite entre les gènes P (phosphoprotéine) et M (matrice) (Combredet, 2003, Journal of Virology, 77 : 11546-11554). Des génomes recombinants MVSchw2-SARS-S et MVSchw2-SARS-Ssol du virus de la rougeole ont été construits par l’insertion des ORFs de la protéine S et du polypeptide Ssol au sein de l’unité de transcription sup- plémentaire du vecteur MVSchw-ATU2.

[0404] Pour cela, un fragment d’ADN contenant le cADN de la S du SRAS-CoV a été amplifié par PCR à l’aide des oligonucléotides 5’-ATACGTACGA CCATGTTTAT TTTCTTATTA TTTCTTACTC TCACT-3’ et 5’-ATAGCGCGCT CAT- TATGTGT AATGTAATTT GACACCCTTG-3’ en utilisant le plasmide pcDNA-S comme matrice puis inséré dans le plasmide pCR®2.1-TOPO (Invitrogen) pour obtenir le plasmide pTOPO-S-MV. Les deux oligonucléotides utilisés con- tiennent des sites de restriction BsiW1 et BssHII, de façon à permettre l’insertion ultérieure dans le vecteur rougeole, et ont été conçus de façon à générer une séquence de 3774 nt incluant les codons d’initiation et de terminaison, afin de respecter la règle des 6 qui stipule que la longueur du génome d’un virus rougeole doit être divisible par 6 (Calain & Roux, 1993, J. Virol., 67 : 4822-4830 ; Schneider et al., 1997, Virology, 227 : 314-322). L’insert a été séquencé à l’aide d’un kit BigDye Terminator v1.1 (Applied Biosystems) et d’un séquenceur automatique ABI377.

[0405] Afin d’exprimer une forme soluble et sécrétée de la S du SRAS-CoV, un plasmide contenant l’ADNc du poly- peptide Ssol correspondant à l’ectodomaine (aa 1-1193) de la S du SRAS-CoV fusionné en son extrémité C-ter à la séquence d’une étiquette FLAG (DYKDDDDK) via un linker BspEl codant pour le dipeptide SG a ensuite été obtenu. Pour cela, un fragment d’ADN a été amplifié à l’aide des oligonucléotides 5’-CCATTTCAAC AATTTGGCCG-3’ et 5’- ATAGGATCCG CGCGCTCATT ATTTATCGTC GTCATCTTTA TAATC-3’ à partir du plasmide pCDNA-Ssol puis inséré dans le plasmide pTOPO-S-MV entre les sites Sall et BamH1 pour obtenir le plasmide pTOPO-S-MV-SF. La séquence générée est longue de 3618 nt entre les sites BsiW1 et BssHII et respecte la règle des 6. L’insert a été séquencé comme indiqué ci-dessus.

[0406] Les fragments BsiW1-BssHII contenant les ADNc de la protéine S et du polypeptide Ssol ont ensuite été excisés par digestion des plasmides pTOPO-S-MV et pTOPO-S-MV-SF puis sous-clonés entre les sites correspondants du plasmide pTM-MVSchw-ATU2 pour donner les plasmides pTM-MVSchw2-SARS-S et pTM-MVSchw2-SARS-Ssol (fi- gure 40B). Ces deux plasmides ont été déposés à la C.N.C.M. le 1er décembre 2004, sous les numéros I-3326 et I- 3327, respectivement.

[0407] Les virus rougeole recombinants correspondants aux plasmides pTM-MVSchw2-SARS-S et pTM-MVSchw2- SARS-Ssol ont été obtenus par génétique inverse selon le système reposant sur l’utilisation d’une lignée cellulaire auxiliaire, décrit par Radecke et coll. (1995, Embo J., 14, : 5773-5784) et modifié par Parks et coll. (1999, J. Virol., 73 : 3560-3566). Brièvement, les cellules auxiliaires 293-3-46 sont transfectées selon la méthode au phosphate de calcium par 5 €g des plasmides pTM-MVSchw2-SARS-S ou pTM-MVSchw2-SARS-Ssol et 0,02 €g du plasmide pEMC-La dirigeant l’expression de la polymérase L du MV (don de M.A. Billeter). Après une nuit d’incubation à 37°C, un choc thermique est réalisé pendant 2 heures à 43°C et les cellules transfectées sont transférées sur une monocouche de cellules Vero. Pour chacun des deux plasmides, des syncytia sont apparus après 2 à 3 jours de co-culture et ont été transférés successivement sur des monocouches de cellules Vero à 70% de confluence en boites de pétri de 35 mm puis en flacons de 25 et 75 cm2. Quand les syncytia ont atteint 80-90% de confluence, les cellules sont récupérées à l’aide d’un grattoir puis congelées et décongelées une fois. Après une centrifugation à basse vitesse, le surnageant contenant le virus est conservé en aliquot à -80°C. Les titres des virus recombinants MVSchw2-SARS-S et MVSchw2- SARS-Ssol ont été déterminés par dilution limite sur cellules Vero et le titre en dose infectant 50% des cupules (TCID50) calculé selon la méthode de Kärber.

3) Caractérisation des virus recombinants

[0408] L’expression des transgènes codant la protéine S et le polypeptide Ssol a été recherchée par western blot et immunofluorescence.

[0409] Des monocouches de cellules Vero en flacons T-25 ont été infectées à une multiplicité de 0,05 par différents passages des deux virus MVSchw2-SARS-S et MVSchw2-SARS-Ssol et le virus sauvage MWSchw à titre de contrôle. Quand les syncytia ont atteint 80 à 90% de confluence, des extraits cytoplasmiques ont été préparés dans un tampon d’extraction (150mMNaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,2, 1% triton-X-100, 0,1% SDS, 1% DOC) puis dilués en tampon de dépôt selon Laemmli, séparés sur un gel SDS à 8% de polyacrylamide et transférés sur une membrane de PVDF (BioRad). La détection de cette immunoempreinte (« western blot») a été réalisée à l’aide d’un sérum polyclonal de lapin anti-S (immun-sérum du lapin P11135 : cf exemple 4 ci-dessus) et d’anticorps polyclonaux d’âne dirigés contre les IgG de lapin et couplés à la peroxidase (NA934V, Amersham). Les anticorps fixés ont été révélés par luminescence à l’aide du kit ECL+ (Amersham) et de films d’autoradiographie Hyperfilm MP (Amersham).

[0410] Des cellules Vero en monocouches sur lamelles de verre ont été infectées par les deux virus MVSchw2-SARS- S et MVSchw2-SARS-Ssol et le virus sauvage MWSchw à titre de contrôle à des multiplicités d’infection de 0,05. Quand les syncytia ont atteint 90 à 100% (virus MVSchw2-SARS-Ssol) ou 30 à 40% (MVSchw2-SARS-S,MWSchw) de con- fluence, les cellules ont été fixées dans une solution de PBS-PFA 4%, perméabilisées par une solution de PBS contenant 0,2% de triton puis marquées par des anticorps polyclonaux de lapins hyperimmunisés par des virions purifiés et inactivés du SRAS-CoV et par un conjugué d’anticorps de chèvre anti-IgG(H+L) de lapin couplé au FITC (Jackson).

[0411] Comme le montrent les figures 41 et 42, les virus recombinants MVSchw2-SARS-S et MVSchw2-SARS-Ssol dirigent l’expression de la protéine S et du polypeptide Ssol respectivement à des niveaux comparables à ceux que l’on peut observer 8h après infection par le SRAS-CoV. L’expression de ces polypeptides est stable après 3 passages des virus recombinants en culture cellulaire. Ces résultats démontrent que les virus rougeole recombinants sont bien porteurs des transgènes et permettent l’expression de la glycoprotéine du SRAS sous sa forme membranaire (S) ou sous une forme soluble (Ssol). On s’attend à ce que le polypeptide Ssol soit sécrété des cellules infectées par le virus MVSchw2- SARS-Ssol comme c’est le cas lorsque ce même polypeptide est exprimé dans des cellules de mammifères après transfection transitoire des séquences correspondantes (cf exemple 11 ci-dessus).

4) Applications

[0412] Ayant montré que les virus MVSchw2-SARS-S et MVSchw2-SARS-Ssol permettent l’expression de la S du SRAS-CoV, leur capacité à induire une réponse immunitaire protectrice contre le SRAS-CoV chez la souris CD46+/- IFN-áâR-/-, qui est susceptible à l’infection par le MV, est évaluée. La réponse en anticorps des souris immunisées est évaluée par test ELISA contre les antigènes natifs du SRAS-CoV et pour leur capacité à neutraliser l’infectivité du SRAS- CoV in vitro, en utilisant les méthodologies décrites ci-dessus. Le pouvoir protecteur de la réponse sera évalué en mesurant la réduction de la charge virale pulmonaire 2 jours après une infection d’épreuve non létale par le SRAS-CoV.

[0413] Des virus rougeole recombinants de seconde génération sont construits en substituant les séquences sauvages des gènes S et Sol par des gènes synthétiques optimisés pour l’expression en cellules de mammifères, décrits à l’exemple 15 ci-dessus. Ces virus rougeole recombinants sont susceptibles d’exprimer des quantités plus importantes des anti- gènes S et Ssol et donc de présenter une immunogénicité accrue.

[0414] Alternativement, les gènes sauvages ou synthétiques codant pour la protéine S ou le polypeptide Ssol peuvent être insérés dans le vecteur rougeole MVSchw-ATU3 sous la forme d’une unité de transcription supplémentaire localisée entre les gènes H et L, puis les virus recombinants produits et caractérisés de façon similaire. Cette insertion est susceptible de générer des virus recombinants possédant des caractéristiques (multiplication du virus, niveau d’expres- sion du transgène) différentes et possiblement une immunogénicité améliorée par rapport à ceux obtenus après insertion des transgènes entre les gènes P et N.

[0415] Le virus rougeole recombinant MVSchw2-SARS-Ssol peut être utilisé pour la production en quantité et la purification de l’antigène Ssol en vue d’applications diagnostiques et vaccinales.

Exemple 18 : Autres applications liées à la protéine S

[0416]

a) Les vecteurs lentiviraux permettant l’expression de la S ou de Ssol (voire de fragments de la S) peuvent constituer un vaccin recombinant contre le SRAS-CoV, pour être utilisé en prophylaxie humaine et vétérinaire. Afin de démontrer la faisabilité d’un tel vaccin, l’immunogénicité des vecteurs lentiviraux recombinants TRIP-SD/SA-S-WPRE et TRIP- SD/SA-Ssol-WPRE est étudiée chez la souris.

b) Des anticorps monoclonaux sont produits à l’aide du polypeptide recombinant Ssol. D’après les résultats présentés à l’exemple 14 ci-dessus, ces anticorps ou du moins la majorité d’entre eux reconnaîtront la forme native de la S du SRAS-CoV et seront susceptibles d’applications diagnostiques et/ou prophylactiques.
c) Un test de sérologie du SRAS est mis au point avec le polypeptide Ssol utilisé comme antigène et la méthodologie du double épitope.

SEQUENCE LISTING

[0417]

<110> INSTITUT PASTEUR
CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE PARIS 7
VAN DER WERF, Sylvie
ESCRIOU, Nicolas
CRESCENZO-CHAIGNE, Bernadette
MANUGUERRA, Jean-Claude
KUNST, Franck
CALLENDRET, Benoît
BETTON, Jean-Michel
LORIN, Valérie
GERBAUD, Sylvie
BURGUIERE, Ana Maria
AZEBI, Saliha
CHARNEAU, Pierre

TANGY, Frédéric

COMBREDET, Chantal

DELAGNEAU, Jean-François

MARTIN, Monique

<120> NOUVELLE SOUCHE DE CORONAVIRUS ASSOCIE AU SRAS ET SES APPLICATIONS

<130> 226-108ext

<150> FR 0314152 <151> 2003-12-02

<150> FR 0314151 <151> 2003-12-02

<160> 158
<170> PatentIn version 3.1

<210> 1
<211> 29746
<212> DNA
<213> CORONAVIRUS

<400> 1

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